Uso de fração vascular estromal derivada de tecido adiposo autólogo para tratar osteoartrite do joelho

Métodos:

Colheita adiposa. Sem sedação oral ou parenteral, solução padrão umectante (1 litro de Ringer com lactato, 50 miligramas de lidocaína a 1% e 1 cc de epinefrina 1:1.000) foi infundida através de pequenas incisões criadas com a ponta de uma lâmina de bisturi nº 11 no abdômen ou flanco usando uma cânula de infusão padrão de múltiplos orifícios. Uma técnica super-wet plus (2 volumes de solução umectante para 1 volume de aspirado de gordura proposto) foi usada para infundir a solução nos compartimentos de gordura profundos e superficiais. Vinte minutos foram permitidos para efeito vasoconstritor máximo da epinefrina. A gordura foi coletada usando o método padrão de lipoaspiração assistida por sucção (SAL) com uma cânula de 3 mm a aproximadamente 0,5 - 0,7 atmosfera de vácuo, aspirando aproximadamente 200-300 cc de lipoaspirado em um recipiente estéril de processamento de tecido (GID SVF-1, Lousiville, CO) para cada joelho a ser tratado.

Método de processamento adiposo. O lipoaspirado foi colhido e processado até a geração do SVF em um único dispositivo descartável estéril GID SVF-1. A unidade GID SVF-1 contém o mecanismo de lavagem, o filtro de malha e a capacidade de centrifugação no mesmo dispositivo. Após a colheita, o lipoaspirado foi lavado três vezes com Solução de Ringer com Lactato 37C com 20 mg de Cipro e 5.000 unidades de heparina por litro e a porção líquida removida usando o sistema de filtro de malha, deixando o tecido adiposo seco dentro do canister. O recipiente foi pesado para determinar a quantidade de gordura seca disponível para processamento posterior. O tecido adiposo lavado foi desagregado usando colagenase Tipo I (Worthington, Lakewood, NJ) a uma concentração de 200 CDU/ml de volume catalítico total onde o volume catalítico total é o volume do tecido adiposo mais um volume igual de Solução de Ringer com Lactato 37C. A colagenase foi injetada no canister através de um .22 estéril filtro de mícron (Millex-MP, Millipore, Cork, Irlanda). O dispositivo com adiposo, tampão e colagenase foi então colocado em um shaker incubado por 40 minutos a 38C a 150 RPM, veja a Figura 1. Após a desagregação, a solução de albumina humana foi adicionada para atingir uma concentração de 2,5% e interromper qualquer atividade adicional de colagenase. O dispositivo foi então centrifugado a 800 g por 10 minutos. O sobrenadante, incluindo todas as células flutuantes e detritos e a fase aquosa, foi removido usando uma porta na parte superior do dispositivo e descartado. O pellet SVF no fundo foi ressuspenso em 10 ml de LR estéril acessado através da porta central do dispositivo usando uma agulha espinhal 14G de 5,5 polegadas (Abbocath-T, Hospira, Sligo, Irlanda). Uma amostra de 0,5 ml da ressuspensão foi coletada em um tubo Eppendorf de 1,5 cc para ser usado para contagem de células e ensaio. As células SVF ressuspensas foram concentradas em uma dose de 3 ml usando um tubo Falcon estéril de 15 ml a 400 g por 4 minutos.

Método de contagem SVF. A contagem de células SVF e a viabilidade foram avaliadas usando um sistema de citometria de imagem ADAM MC (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). O ADAM MC usa coloração de iodeto de propídio para contar células nucleadas viáveis ​​e não viáveis. Uma alíquota de 100 µL da amostra de ensaio foi diluída com uma proporção de 1:5 (1 parte de amostra para 5 partes de LR estéril) para ajustar a amostra dentro dos limites operacionais do ADAM MC. As manchas diferenciais foram aplicadas e as alíquotas carregadas no cassete descartável que é utilizado com o dispositivo ADAM. Os resultados do dispositivo de contagem ADAM fornecem a concentração de células SVF na seringa de ressuspensão e a porcentagem de viabilidade. O volume total da ressuspensão na seringa foi multiplicado pela concentração para fornecer o número total de células mononucleadas ressuspensas (sem células adiposas, sem hemácias e sem fragmentos incluídos no processo de contagem).

Método de injeção e orientação por imagem. O paciente foi colocado em decúbito dorsal e a área sobre a região suprapatelar lateral do joelho foi preparada da maneira estéril usual usando uma solução de preparação de iodo (1% Iodophor) seguida de uma solução de álcool isopropílico a 70%. Esse local foi utilizado devido à facilidade de acesso ao espaço intra-articular e para evitar a injeção no coxim gorduroso do joelho. Nenhuma sedação ou medicação para dor foi administrada ao paciente. Um anestésico tópico de cloreto de etila foi borrifado na lateral do joelho até que a cor da pele mudasse para branco. O anestésico local lidocaína foi injetado com uma agulha de calibre 25 para anestesiar a pele e os tecidos subcutâneos. Usando um sistema de ultrassom M-Turbo Sonosite, o espaço articular foi identificado e, sob a orientação de ultrassom ao vivo, o joelho foi aspirado usando um calibre 18/1,5 agulha de polegada, se houver fluidos disponíveis para aspiração. Em seguida, todos os 3 cc de solução tamponada de SVF foram injetados lentamente no espaço intra-articular através do mesmo calibre 18/1,5 agulha de polegada. A agulha foi então removida e a pressão direta sobre o local da injeção será aplicada por aproximadamente dez (10) segundos. A hemostasia após a injeção foi confirmada e, em seguida, o local da injeção foi limpo com um pano embebido em álcool e coberto com um curativo estéril. O paciente recebeu muletas e foi solicitado que não suportasse peso no joelho injetado por dois (2) dias. O paciente foi autorizado a dobrar e flexionar o joelho, desde que a condição de não sustentação de peso fosse mantida.

Métodos de avaliação da dor e da mobilidade. A avaliação da dor no joelho foi feita usando os instrumentos de dor PROMIS, um sistema de escala de dor validado desenvolvido com financiamento do NIH. PROMIS (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) é um sistema de medidas do estado de saúde relatado pelo paciente para bem-estar físico, mental e social, incluindo três medidas de dor (www.nihpromis.org). O instrumento PROMIS Pain Intensity (3a) avalia o quanto uma pessoa dói. O instrumento PROMIS Pain Behavior (Banco 1.0) mede os comportamentos que indicam aos outros que um indivíduo está sentindo dor. O instrumento PROMIS Pain Interference (Banco 1.0) mede as consequências da dor em aspectos relevantes da vida de uma pessoa. As respostas do paciente são convertidas em valores numéricos em uma escala validada. As respostas para cada pergunta em um instrumento de dor variam de 1 a 5 (1=nada, 2=um pouco, 3=um pouco, 4=bastante, 5=muito) e são somadas ao número de perguntas no banco para criar uma pontuação bruta. A pontuação bruta é convertida em uma pontuação padronizada usando um método de resposta iterativa com média de 50 e DP de 10, com base em uma grande amostra da população geral dos Estados Unidos. As escalas de dor PROMIS validadas fornecem dados de intervalo e permitem o cálculo da média e SD, e uso de testes t de significância. Os dados foram registrados no pré-operatório (tempo 0) e nos pontos de acompanhamento em 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas e 12 semanas.

Além disso, os pacientes foram solicitados a responder a um questionário de dor e mobilidade com uma pergunta sobre dor e uma pergunta sobre mobilidade. O questionário pedia ao paciente para comparar o aumento/diminuição da dor e mobilidade em relação ao período anterior à cirurgia, usando uma escala de ± 1-5, ver Figura 2. Nesta escala, números negativos correspondem a diminuição da dor/mobilidade e números positivos correspondem a aumento dor/mobilidade. Este questionário fornece dados ordinais e permite o cálculo da mediana e da significância usando testes não paramétricos Wilcoxon Ranked Sums.