Verwendung einer aus autologem Fett gewonnenen stromalen Gefäßfraktion zur Behandlung von Osteoarthritis des Knies

Methoden:

Fetternte. Ohne orale oder parenterale Sedierung wurde eine Standard-Benetzungslösung (1 Liter Ringer-Laktat, 50 Milligramm 1%iges Lidocain und 1 ml 1:1000 Epinephrin) durch kleine Einschnitte infundiert, die mit der Spitze einer Nr. 11-Skalpellklinge im Abdomen erzeugt wurden oder Flanke mit einer Standard-Infusionskanüle mit mehreren Löchern. Eine Super-Wet-Plus-Technik (2 Volumina Benetzungslösung auf 1 Volumen vorgeschlagenes Fettaspirat) wurde verwendet, um die Lösung in die tiefen und oberflächlichen Fettkompartimente zu infundieren. Für eine maximale vasokonstriktive Wirkung des Epinephrins wurden 20 Minuten zugelassen. Fett wurde unter Verwendung der Standardmethode der saugunterstützten Fettabsaugung (SAL) mit einer 3-mm-Kanüle bei etwa 0,5–0,7 Atmosphären Vakuum gewonnen, wobei etwa 200–300 ml Lipoaspirat in einen sterilen Gewebeverarbeitungsbehälter (GID SVF-1, Lousiville, CO) für jedes zu behandelnde Knie.

Fettverarbeitungsverfahren. Lipoaspirat wurde geerntet und bis zur Erzeugung des SVF in einem einzigen sterilen Einweggerät GID SVF-1 verarbeitet. Die GID SVF-1-Einheit enthält den Waschmechanismus, den Maschenfilter und die Zentrifugenfunktion in demselben Gerät. Nach der Ernte wurde das Lipoaspirat dreimal mit 37C-Ringer-Laktatlösung mit 20 mg Cipro und 5.000 Einheiten Heparin pro Liter gewaschen und der Flüssigkeitsanteil unter Verwendung des Maschenfiltersystems entfernt, wobei trockenes Fett im Kanister zurückblieb. Der Kanister wurde gewogen, um die Menge an trockenem Fett zu bestimmen, die für die weitere Verarbeitung verfügbar war. Das gewaschene Fett wurde unter Verwendung von Collagenase vom Typ I (Worthington, Lakewood, NJ) bei einer Konzentration von 200 CDU/ml katalytischem Gesamtvolumen disaggregiert, wobei das katalytische Gesamtvolumen das Volumen des Fettgewebes plus ein gleiches Volumen von 37C Ringer-Laktatlösung ist. Die Collagenase wurde durch eine sterile 0,22 in den Kanister injiziert Mikrometerfilter (Millex-MP, Millipore, Cork, Irland). Das Gerät mit Fett, Puffer und Kollagenase wurde dann für 40 Minuten bei 38 °C und 150 U/min in einen inkubierten Schüttler gegeben, siehe Abbildung 1. Nach der Disaggregation wurde Humanalbuminlösung zugegeben, um eine Konzentration von 2,5 % zu erreichen und jede weitere Kollagenaseaktivität zu stoppen. Die Vorrichtung wurde dann 10 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der Überstand, einschließlich aller schwimmenden Zellen und Debris und der wässrigen Phase, wurde unter Verwendung einer Öffnung auf der Oberseite der Vorrichtung entfernt und verworfen. Das SVF-Pellet am Boden wurde in 10 ml sterilem LR resuspendiert, auf das über den zentralen Anschluss an der Vorrichtung unter Verwendung einer 14 G 5,5-Zoll-Spinalnadel (Abbocath-T, Hospira, Sligo, Irland) zugegriffen wurde. Eine Probe von 0,5 ml der Resuspension wurde in einem 1,5-cm³-Eppendorf-Röhrchen gesammelt, um für die Zellzählung und den Assay verwendet zu werden. Die resuspendierten SVF-Zellen wurden unter Verwendung eines sterilen 15-ml-Falcon-Röhrchens bei 400 g für 4 Minuten zu einer 3-ml-Dosis konzentriert.

SVF-Zählmethode. Die SVF-Zellzahl und -Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines ADAM MC-Bildzytometriesystems (Bulldog Bio, Portsmouth, NH) bewertet. Der ADAM MC verwendet eine Propidiumiodid-Färbung, um lebensfähige und nicht lebensfähige kernhaltige Zellen zu zählen. Ein 100-µl-Aliquot der Testprobe wurde im Verhältnis 1:5 verdünnt (1 Teil Probe zu 5 Teilen steriles LR), um die Probe innerhalb der Betriebsgrenzen des ADAM MC einzustellen. Die Differentialfärbungen wurden aufgetragen und Aliquots in die Einwegkassette geladen, die mit dem ADAM-Gerät verwendet wird. Die Ergebnisse des ADAM-Zählgeräts liefern die Konzentration von SVF-Zellen in der Resuspensionsspritze und die prozentuale Lebensfähigkeit. Das Gesamtvolumen der Resuspension in der Spritze wurde mit der Konzentration multipliziert, um die Gesamtzahl der resuspendierten mononukleären Zellen zu ergeben (keine Fettzellen, keine RBCs und keine Fragmente, die in den Zählprozess einbezogen wurden).

Injektions- und Bildführungsverfahren. Der Patient wurde in Rückenlage gebracht und der Bereich über der lateralen suprapatellaren Region des Knies wurde auf die übliche sterile Weise unter Verwendung einer Jodpräparationslösung (1 % Jodophor), gefolgt von einer 70 %igen Isopropylalkohollösung, präpariert. Diese Stelle wurde aufgrund des leichten Zugangs in den intraartikulären Raum und zur Vermeidung einer Injektion in das Fettpolster des Knies verwendet. Dem Patienten wurden keine Beruhigungs- oder Schmerzmittel verabreicht. Ein topisches Ethylchlorid-Anästhetikum wurde auf das seitliche Knie gesprüht, bis sich die Hautfarbe zu Weiß änderte. Lidocain-Lokalanästhetikum wurde unter Verwendung einer 25-Gauge-Nadel injiziert, um die Haut und das subkutane Gewebe zu betäuben. Mit einem M-Turbo Sonosite-Ultraschallsystem wurde der Gelenkspalt identifiziert und das Knie unter Live-Ultraschallführung mit einem 18 Gauge/1,5 abgesaugt Inch-Nadel, wenn Flüssigkeiten zur Aspiration verfügbar waren. Dann wurden die gesamten 3 cc der gepufferten SVF-Lösung langsam in den intraartikulären Raum durch das gleiche 18 Gauge/1,5 injiziert Zoll Nadel. Die Nadel wurde dann entfernt und etwa zehn (10) Sekunden lang direkter Druck auf die Injektionsstelle ausgeübt. Die Hämostase nach der Injektion wurde bestätigt, und dann wurde die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer gereinigt und mit einem sterilen Pflaster abgedeckt. Dem Patienten wurden Krücken gegeben und er wurde gebeten, zwei (2) Tage lang das injizierte Knie nicht zu belasten. Dem Patienten wurde erlaubt, das Knie zu beugen und zu beugen, solange der Zustand ohne Belastung aufrechterhalten wurde.

Schmerz- und Mobilitätsbewertungsmethoden. Die Beurteilung der Knieschmerzen erfolgte mit den PROMIS-Schmerzinstrumenten, einem validierten Schmerzskalensystem, das mit finanzieller Unterstützung des NIH entwickelt wurde. PROMIS (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) ist ein System zur Messung des von Patienten gemeldeten Gesundheitszustands für körperliches, geistiges und soziales Wohlbefinden, einschließlich drei Schmerzmessungen (www.nihpromis.org). Das PROMIS-Schmerzintensitätsinstrument (3a) bewertet, wie sehr eine Person schmerzt. Das PROMIS Schmerzverhaltensinstrument (Bank 1.0) misst Verhaltensweisen, die anderen anzeigen, dass eine Person Schmerzen hat. Das Instrument PROMIS Pain Interference (Bank 1.0) misst die Auswirkungen von Schmerzen auf relevante Aspekte des eigenen Lebens. Patientenantworten werden in numerische Werte in einer validierten Skala umgewandelt. Die Antworten auf jede Frage in einem Schmerzinstrument reichen von 1 bis 5 (1 = überhaupt nicht, 2 = ein wenig, 3 = etwas, 4 = ziemlich, 5 = sehr stark) und werden über die Anzahl der Fragen summiert in der Bank, um eine Rohpartitur zu erstellen. Der Rohwert wird mithilfe einer iterativen Antwortmethode mit einem Mittelwert von 50 und einer SD von 10 in einen standardisierten Wert umgewandelt, der auf einer großen Stichprobe der allgemeinen Bevölkerung der Vereinigten Staaten basiert. Die validierten PROMIS-Schmerzskalen liefern Intervalldaten und ermöglichen die Berechnung des Mittelwerts und der SD sowie die Verwendung von t-Tests auf Signifikanz. Die Daten wurden präoperativ (Zeitpunkt 0) und zu Nachsorgezeitpunkten nach 2 Wochen, 4 Wochen, 6 Wochen und 12 Wochen aufgezeichnet.

Zusätzlich wurden die Patienten gebeten, einen Schmerz- und Mobilitätsfragebogen mit einer Frage zu Schmerzen und einer Frage zur Mobilität zu beantworten. Der Fragebogen bat den Patienten, seine Zunahme/Abnahme von Schmerzen und Mobilität im Vergleich zu vor der Operation auf einer Skala von ± 1–5 zu vergleichen, siehe Abbildung 2. Auf dieser Skala entsprechen negative Zahlen abnehmenden Schmerzen/Beweglichkeit und positive Zahlen zunehmenden Schmerzen/Beweglichkeit. Dieser Fragebogen liefert ordinale Daten und ermöglicht die Berechnung des Medians und der Signifikanz mithilfe von Wilcoxon-Ranglisten-Summen-nichtparametrischen Tests.