Gebruik van autologe van vetweefsel afgeleide stromale vasculaire fractie om artrose van de knie te behandelen

methoden:

Vetoogst. Zonder orale of parenterale sedatie werd standaard bevochtigingsoplossing (1 liter Lactated Ringer's, 50 milligram 1% lidocaïne en 1 cc 1:1000 epinefrine) toegediend via kleine incisies gemaakt met de punt van een nr. 11 scalpelmesje in de buik of flankeren met behulp van een standaard infuuscanule met meerdere gaten. Een super-wet plus-techniek (2 volumes bevochtigingsoplossing op 1 volume voorgesteld vetaspiraat) werd gebruikt om de oplossing in de diepe en oppervlakkige vetcompartimenten te infunderen. Er werd twintig minuten toegestaan ​​voor een maximaal vasoconstrictief effect van het epinefrine. Vet werd geoogst met behulp van standaard Suction-Assisted Liposuctie (SAL) -methode met een 3 mm canule bij ongeveer 0,5 - 0,7 atmosfeer vacuüm, waarbij ongeveer 200-300 cc lipoaspiraat werd opgezogen in een steriele weefselverwerkingscontainer (GID SVF-1, Lousiville, CO) voor elke te behandelen knie.

Vetverwerkingsmethode. Lipoaspiraat werd geoogst en verwerkt tot aan het genereren van de SVF binnen een enkel GID SVF-1 steriel wegwerpapparaat. De GID SVF-1-eenheid bevat het wasmechanisme, het gaasfilter en de centrifugeerfunctie in hetzelfde apparaat. Na de oogst werd het lipoaspiraat driemaal gewassen met 37C Lactated Ringer's Solution met 20 mg Cipro en 5.000 eenheden heparine per liter en het vloeibare gedeelte werd verwijderd met behulp van het gaasfiltersysteem, waarbij droog vet in de bus achterbleef. De bus werd gewogen om de hoeveelheid droog vet te bepalen die beschikbaar was voor verdere verwerking. Het gewassen vet werd gedesaggregeerd met behulp van Type I collagenase (Worthington, Lakewood, NJ) bij een concentratie van 200 CDU/ml van het totale katalytische volume, waarbij het totale katalytische volume het volume van het vetweefsel is plus een gelijk volume van 37C Lactated Ringer's Solution. De collagenase werd in de bus geïnjecteerd door een steriele .22 micronfilter (Millex-MP, Millipore, Cork, Ierland). Het apparaat met vet, buffer en collagenase werd vervolgens gedurende 40 minuten bij 38°C bij 150 RPM in een geïncubeerde shaker geplaatst, zie figuur 1. Na disaggregatie werd een humane albumine-oplossing toegevoegd om een ​​concentratie van 2,5% te bereiken en verdere collagenase-activiteit te stoppen. Het apparaat werd vervolgens gedurende 10 minuten bij 800 g gecentrifugeerd. Het supernatant, inclusief alle drijvende cellen en afval en de waterige fase, werd verwijderd met behulp van een opening aan de bovenzijde van het apparaat en weggegooid. De SVF-pellet aan de onderkant werd geresuspendeerd in 10 ml steriele LR die toegankelijk was via de centrale poort op het apparaat met behulp van een 14G 5,5 inch spinale naald (Abbocath-T, Hospira, Sligo, Ierland). Een monster van 0,5 ml van de hersuspensie werd verzameld in een Eppendorf-buis van 1,5 cc om te worden gebruikt voor celtelling en assay. De opnieuw gesuspendeerde SVF-cellen werden geconcentreerd tot een dosis van 3 ml met behulp van een steriele Falcon-buis van 15 ml bij 400 g gedurende 4 minuten.

SVF-telmethode. Het aantal en de levensvatbaarheid van SVF-cellen werd beoordeeld met behulp van een ADAM MC-beeldcytometriesysteem (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). De ADAM MC gebruikt kleuring met propidiumjodide om levensvatbare en niet-levensvatbare cellen met kern te tellen. Een aliquot van 100 µl van het assaymonster werd verdund met een verhouding van 1:5 (1 deel monster op 5 delen steriel LR) om het monster aan te passen binnen de werkingsgrenzen van de ADAM MC. De differentiële kleuringen werden aangebracht en aliquots werden geladen in de wegwerpcassette die wordt gebruikt met het ADAM-apparaat. De resultaten van het ADAM-telapparaat geven de concentratie van SVF-cellen in de resuspensiespuit en het percentage levensvatbaarheid weer. Het totale volume van de resuspensie in de injectiespuit werd vermenigvuldigd met de concentratie om het totale aantal geresuspendeerde mononucleaire cellen te verkrijgen (geen vetcellen, geen RBC's en geen fragmenten opgenomen in het telproces).

Injectie- en beeldgeleidingsmethode. De patiënt werd in rugligging geplaatst en het gebied boven het laterale suprapatellaire gebied van de knie werd op de gebruikelijke steriele wijze geprepareerd met behulp van een jodiumbereidingsoplossing (1% Iodophor) gevolgd door een 70% isopropylalcoholoplossing. Deze locatie werd gebruikt vanwege de gemakkelijke toegang tot de intra-articulaire ruimte en om injectie in het vetkussen van de knie te voorkomen. Er werd geen sedatie of pijnmedicatie toegediend aan de patiënt. Een plaatselijke verdoving met ethylchloride werd op de laterale knie gespoten totdat de huidskleur in wit veranderde. Lidocaïne lokaal anestheticum werd geïnjecteerd met behulp van een naald van 25 gauge om de huid en onderhuidse weefsels te verdoven. Met behulp van een M-Turbo Sonosite-echografiesysteem werd de gewrichtsruimte geïdentificeerd en onder live-echografie werd de knie geaspireerd met een 18 gauge/1,5 inch naald, als er vloeistoffen beschikbaar waren voor aspiratie. Vervolgens werd alle 3 cc gebufferde oplossing van SVF langzaam geïnjecteerd in de intra-articulaire ruimte via dezelfde 18 gauge/1,5 inch naald. De naald wordt vervolgens verwijderd en er wordt gedurende ongeveer tien (10) seconden directe druk op de injectieplaats uitgeoefend. Hemostase na injectie werd bevestigd en vervolgens werd de injectieplaats schoongemaakt met een alcoholdoekje en bedekt met een steriele pleister. De patiënt kreeg krukken en werd gevraagd gedurende twee (2) dagen niet te belasten op de geïnjecteerde knie. De patiënt mocht de knie buigen en buigen zolang de niet-belaste toestand behouden blijft.

Beoordelingsmethoden voor pijn en mobiliteit. Beoordeling van kniepijn werd gedaan met behulp van de PROMIS-pijninstrumenten, een gevalideerd pijnschaalsysteem dat is ontwikkeld met financiering door de NIH. PROMIS (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) is een systeem voor het meten van de door de patiënt gerapporteerde gezondheidsstatus voor fysiek, mentaal en sociaal welzijn, waaronder drie metingen van pijn (www.nihpromis.org). Het PROMIS Pijnintensiteitsinstrument (3a) beoordeelt hoeveel pijn iemand heeft. Het PROMIS Pijngedrag-instrument (Bank 1.0) meet gedrag dat aan anderen aangeeft dat een individu pijn ervaart. Het instrument PROMIS Pijninterferentie (Bank 1.0) meet de gevolgen van pijn op relevante aspecten van het leven. Reacties van patiënten worden omgezet in numerieke waarden in een gevalideerde schaal. Antwoorden op elke vraag in een pijninstrument variëren van 1 tot 5 (1=helemaal niet, 2=een beetje, 3=enigszins, 4=behoorlijk, 5=zeer veel), en worden opgeteld over het aantal vragen op de bank om een ​​ruwe score te creëren. De ruwe score wordt geconverteerd naar een gestandaardiseerde score met behulp van een iteratieve responsmethode met een gemiddelde van 50 en SD van 10, gebaseerd op een grote steekproef van de algemene bevolking van de Verenigde Staten. De gevalideerde PROMIS-pijnschalen bieden intervalgegevens en maken berekening van het gemiddelde en SD mogelijk, en het gebruik van t-testen van significantie. Gegevens werden preoperatief geregistreerd (tijdstip 0) en op follow-uppunten na 2 weken, 4 weken, 6 weken en 12 weken.

Daarnaast werd patiënten gevraagd om een ​​pijn- en mobiliteitsvragenlijst in te vullen met één vraag over pijn en één vraag over mobiliteit. De vragenlijst vroeg de patiënt om hun toename/afname in pijn en mobiliteit te vergelijken met vóór de operatie, met behulp van een schaal van ± 1-5, zie figuur 2. Op deze schaal komen negatieve getallen overeen met afnemende pijn/mobiliteit en positieve getallen komen overeen met toenemende pijn/mobiliteit. Deze vragenlijst biedt ordinale gegevens en maakt berekening van de mediaan en significantie mogelijk met behulp van Wilcoxon Geclassificeerde Sums niet-parametrische tests.