Zastosowanie autologicznej frakcji naczyniowej zrębu pochodzącej z tkanki tłuszczowej w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego

Metody:

Zbiory tłuszczu. Nie stosując sedacji doustnej ani pozajelitowej, standardowy roztwór zwilżający (1 litr płynu Ringera z mleczanem, 50 miligramów 1% lidokainy i 1 cm3 epinefryny 1:1000) wstrzyknięto przez małe nacięcia wykonane czubkiem ostrza skalpela nr 11 w jamie brzusznej lub flankować za pomocą standardowej kaniuli infuzyjnej z wieloma otworami. Zastosowano technikę super-wet plus (2 objętości roztworu zwilżającego na 1 objętość proponowanej aspiratu tłuszczu) do wprowadzenia roztworu do głębokich i powierzchownych przedziałów tłuszczowych. Maksymalny efekt zwężenia naczyń epinefryny pozostawiono na 20 minut. Tłuszcz zebrano przy użyciu standardowej metody liposukcji wspomaganej odsysaniem (SAL) za pomocą 3 mm kaniuli przy około 0,5–0,7 atmosfery próżni, zasysając około 200-300 cm3 lipoaspiratu do sterylnego pojemnika do obróbki tkanek (GID SVF-1, Lousiville, CO) dla każdego kolana, które ma być leczone.

Metoda przetwarzania tkanki tłuszczowej. Lipoaspirat został zebrany i przetworzony aż do wytworzenia SVF w jednym sterylnym jednorazowym urządzeniu GID SVF-1. Jednostka GID SVF-1 zawiera mechanizm myjący, filtr siatkowy i możliwość wirowania w tym samym urządzeniu. Po zebraniu lipoaspirat przemyto trzykrotnie roztworem Ringera z mleczanem 37C z 20 mg Cipro i 5000 jednostek heparyny na litr i część płynu usunięto za pomocą systemu filtrów siatkowych, pozostawiając suchą tkankę tłuszczową wewnątrz pojemnika. Pojemnik zważono w celu określenia ilości suchej tkanki tłuszczowej dostępnej do dalszego przetwarzania. Przemytą tkankę tłuszczową dezagregowano stosując kolagenazę typu I (Worthington, Lakewood, NJ) w stężeniu 200 CDU/ml całkowitej objętości katalitycznej, gdzie całkowita objętość katalityczna jest objętością tkanki tłuszczowej plus równą objętość 37C roztworu Ringera z mleczanem. Kolagenazę wstrzyknięto do pojemnika przez sterylny .22 filtr mikronowy (Millex-MP, Millipore, Cork, Irlandia). Urządzenie z tłuszczem, buforem i kolagenazą umieszczono następnie w inkubowanej wytrząsarce na 40 minut w temperaturze 38°C przy 150 obr./min, patrz rysunek 1. Po dezagregacji dodano roztwór ludzkiej albuminy do uzyskania stężenia 2,5% i zatrzymania dalszej aktywności kolagenazy. Następnie urządzenie wirowano przy 800 g przez 10 minut. Supernatant, w tym wszystkie pływające komórki i pozostałości oraz fazę wodną, ​​usunięto przez otwór w górnej części urządzenia i odrzucono. Osad SVF na dnie ponownie zawieszono w 10 ml sterylnego LR, do którego dostęp uzyskano przez centralny port na urządzeniu, stosując igłę rdzeniową 14G 5,5 cala (Abbocath-T, Hospira, Sligo, Irlandia). Próbkę 0,5 ml zawiesiny pobrano do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 cm3 i użyto do zliczenia komórek i oznaczenia. Ponownie zawieszone komórki SVF zatężono do dawki 3 ml, stosując sterylną 15 ml probówkę Falcon przy 400 g przez 4 minuty.

Metoda liczenia SVF. Liczbę i żywotność komórek SVF oceniono stosując system cytometrii obrazowej ADAM MC (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). ADAM MC wykorzystuje barwienie jodkiem propidyny do zliczania żywych i nieżywych komórek jądrzastych. Porcję 100 ul badanej próbki rozcieńczono w stosunku 1:5 (1 część próbki na 5 części sterylnego LR), aby dostosować próbkę do granic roboczych ADAM MC. Zastosowano barwniki różnicujące i porcje załadowano do jednorazowej kasety, która jest używana z urządzeniem ADAM. Wyniki z licznika ADAM dostarczają stężenia komórek SVF w strzykawce do resuspensji i procentowej żywotności. Całkowitą objętość zawiesiny w strzykawce pomnożono przez stężenie, otrzymując całkowitą liczbę ponownie zawieszonych komórek jednojądrzastych (bez komórek tłuszczowych, bez erytrocytów i bez fragmentów objętych procesem zliczania).

Metoda iniekcji i prowadzenia obrazu. Pacjenta ułożono w pozycji leżącej, a obszar nad boczną częścią nadrzepkową kolana przygotowano w zwykły sterylny sposób, stosując preparat jodowy (1% jodofor), a następnie 70% roztwór alkoholu izopropylowego. Lokalizacja ta została wybrana ze względu na łatwy dostęp do przestrzeni dostawowej oraz uniknięcie iniekcji w poduszeczkę tłuszczową kolana. Choremu nie podano środków uspokajających ani przeciwbólowych. Miejscowy środek znieczulający chlorku etylu rozpylono na boczne kolano, aż kolor skóry zmienił się na biały. Lidokainę znieczulającą miejscowo wstrzyknięto igłą nr 25 w celu znieczulenia skóry i tkanki podskórnej. Za pomocą systemu ultrasonograficznego M-Turbo Sonosite zidentyfikowano szpary stawowe i pod kontrolą USG na żywo aspirowano kolano za pomocą aparatu 18 G/1,5 cala igły, jeśli płyny były dostępne do aspiracji. Następnie wszystkie 3 cm3 buforowanego roztworu SVF powoli wstrzyknięto do przestrzeni dostawowej przez ten sam 18G/1,5 calowa igła. Następnie usunięto igłę i bezpośrednio uciskano miejsce wstrzyknięcia przez około dziesięć (10) sekund. Potwierdzono hemostazę po iniekcji, a następnie miejsce iniekcji oczyszczono gazikiem nasączonym alkoholem i założono jałowy opatrunek. Pacjentowi podano kule i poproszono go o nieobciążanie stawu kolanowego, w który wstrzyknięto, przez dwa (2) dni. Pacjentowi pozwolono zginać i zginać kolano tak długo, jak zachowany jest stan odciążenia.

Metody oceny bólu i mobilności. Oceny bólu kolana dokonano za pomocą narzędzi do pomiaru bólu PROMIS, zatwierdzonego systemu skali bólu opracowanego w ramach finansowania przez NIH. PROMIS (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) to system służący do pomiaru stanu zdrowia zgłaszanego przez pacjentów w zakresie fizycznego, psychicznego i społecznego samopoczucia, w tym trzech pomiarów bólu (www.nihpromis.org). Instrument PROMIS Pain Intensity (3a) ocenia, jak bardzo dana osoba boli. Instrument PROMIS Pain Behavior (Bank 1.0) mierzy zachowania, które wskazują innym, że dana osoba doświadcza bólu. Instrument PROMIS Pain Interference (Bank 1.0) mierzy konsekwencje bólu w odpowiednich aspektach życia. Odpowiedzi pacjentów są konwertowane na wartości liczbowe w zatwierdzonej skali. Odpowiedzi na każde pytanie w instrumencie przeciwbólowym wahają się od 1 do 5 (1=wcale, 2=trochę, 3=nieco, 4=raczej trochę, 5=bardzo) i są sumowane przez liczbę pytań w banku, aby stworzyć surowy wynik. Surowy wynik jest konwertowany na standardowy wynik przy użyciu iteracyjnej metody odpowiedzi ze średnią 50 i SD 10, w oparciu o dużą próbę ogólnej populacji Stanów Zjednoczonych. Zwalidowane skale bólu PROMIS dostarczają danych interwałowych i umożliwiają obliczenie średniej i odchylenia standardowego oraz zastosowanie t-testów istotności. Dane rejestrowano przed operacją (czas 0) oraz w punktach kontrolnych po 2 tygodniach, 4 tygodniach, 6 tygodniach i 12 tygodniach.

Dodatkowo pacjentów poproszono o wypełnienie kwestionariusza dotyczącego bólu i mobilności, z jednym pytaniem dotyczącym bólu i jednym pytaniem dotyczącym mobilności. W kwestionariuszu poproszono pacjenta o porównanie wzrostu/zmniejszenia bólu i ruchomości w stosunku do stanu przed operacją, używając skali ± 1-5, patrz ryc. 2. Na tej skali liczby ujemne odpowiadają zmniejszeniu bólu/ruchomości, a liczby dodatnie odpowiadają zwiększeniu ból/mobilność. Ten kwestionariusz dostarcza danych porządkowych i umożliwia obliczenie mediany i istotności przy użyciu testów nieparametrycznych Wilcoxon Ranking Sums.