Uso della frazione stromale vascolare autologa di derivazione adiposa per il trattamento dell'artrosi del ginocchio

Metodi:

Raccolto adiposo. Senza sedazione orale o parenterale, è stata infusa una soluzione umettante standard (1 litro di Ringer lattato, 50 milligrammi di lidocaina all'1% e 1 cc di epinefrina 1:1000) attraverso piccole incisioni praticate con la punta di una lama di bisturi n. 11 nell'addome o sul fianco utilizzando una cannula per infusione multiforo standard. È stata utilizzata una tecnica super-wet plus (2 volumi di soluzione umettante per 1 volume di grasso aspirato proposto) per infondere la soluzione nei compartimenti adiposi profondi e superficiali. Sono stati concessi venti minuti per il massimo effetto vasocostrittore dell'epinefrina. Il grasso è stato raccolto utilizzando il metodo standard di liposuzione aspirata-assistita (SAL) con una cannula da 3 mm a circa 0,5 - 0,7 atmosfere di vuoto, aspirando circa 200-300 cc di lipoaspirato in un contenitore sterile per la lavorazione dei tessuti (GID SVF-1, Lousiville, CO) per ciascun ginocchio da trattare.

Metodo di elaborazione adiposo. Il lipoaspirato è stato raccolto ed elaborato fino alla generazione della SVF all'interno di un singolo dispositivo monouso sterile GID SVF-1. L'unità GID SVF-1 contiene il meccanismo di lavaggio, il filtro a rete e la capacità di centrifuga nello stesso dispositivo. Dopo la raccolta, il lipoaspirato è stato lavato tre volte con soluzione di Ringer lattato 37C con 20 mg di Cipro e 5.000 unità di eparina per litro e la parte fluida è stata rimossa utilizzando il sistema di filtri a rete, lasciando l'adiposo secco all'interno del contenitore. Il contenitore è stato pesato per determinare la quantità di adiposo secco disponibile per l'ulteriore lavorazione. L'adiposo lavato è stato disaggregato utilizzando la collagenasi di tipo I (Worthington, Lakewood, NJ) ad una concentrazione di 200 CDU/ml di volume catalitico totale dove il volume catalitico totale è il volume del tessuto adiposo più un volume uguale di soluzione di Ringer lattato 37C. La collagenasi è stata iniettata nel contenitore attraverso un .22 sterile filtro micron (Millex-MP, Millipore, Cork, Irlanda). Il dispositivo con adiposo, tampone e collagenasi è stato quindi posto in un agitatore incubato per 40 minuti a 38°C a 150 RPM, vedere la Figura 1. Dopo la disaggregazione è stata aggiunta una soluzione di albumina umana per ottenere una concentrazione del 2,5% e arrestare qualsiasi ulteriore attività di collagenasi. Il dispositivo è stato quindi centrifugato a 800 g per 10 minuti. Il surnatante, comprese tutte le cellule galleggianti, i detriti e la fase acquosa, è stato rimosso utilizzando una porta sulla parte superiore del dispositivo e scartato. Il pellet SVF sul fondo è stato risospeso in 10 ml di LR sterile accessibile tramite la porta centrale del dispositivo utilizzando un ago spinale da 14 G da 5,5 pollici (Abbocath-T, Hospira, Sligo, Irlanda). Un campione di 0,5 ml della risospensione è stato raccolto in una provetta Eppendorf da 1,5 cc da utilizzare per il conteggio delle cellule e l'analisi. Le cellule SVF risospese sono state concentrate in una dose da 3 ml utilizzando una provetta Falcon sterile da 15 ml a 400 g per 4 minuti.

Metodo di conteggio SVF. Il conteggio e la vitalità delle cellule SVF sono stati valutati utilizzando un sistema di citometria dell'immagine ADAM MC (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). ADAM MC utilizza la colorazione con ioduro di propidio per contare le cellule nucleate vitali e non vitali. Un'aliquota di 100 µL del campione del test è stata diluita con un rapporto 1:5 (1 parte di campione su 5 parti di LR sterile) per regolare il campione entro i limiti operativi dell'ADAM MC. Le colorazioni differenziali sono state applicate e le aliquote sono state caricate nella cassetta monouso utilizzata con il dispositivo ADAM. I risultati del dispositivo di conteggio ADAM forniscono la concentrazione di cellule SVF nella siringa di risospensione e la percentuale di vitalità. Il volume totale della risospensione nella siringa è stato moltiplicato per la concentrazione per dare il numero totale di cellule mononucleate risospese (nessuna cellula adiposa, nessun RBC e nessun frammento incluso nel processo di conteggio).

Iniezione e metodo di guida dell'immagine. Il paziente è stato posto in posizione supina e l'area al di sopra della regione sovrarotulea laterale del ginocchio è stata preparata nel solito modo sterile utilizzando una soluzione di preparazione allo iodio (Iodoforo all'1%) seguita da una soluzione di alcol isopropilico al 70%. Questa posizione è stata utilizzata per facilitare l'accesso allo spazio intra-articolare e per evitare l'iniezione nel cuscinetto adiposo del ginocchio. Al paziente non è stata somministrata alcuna sedazione o antidolorifico. Un anestetico topico di cloruro di etile è stato spruzzato sul ginocchio laterale fino a quando il colore della pelle è diventato bianco. L'anestetico locale di lidocaina è stato iniettato utilizzando un ago calibro 25 per intorpidire la pelle e i tessuti sottocutanei. Utilizzando un sistema ecografico M-Turbo Sonosite, è stato identificato lo spazio articolare e sotto guida ecografica dal vivo il ginocchio è stato aspirato utilizzando un calibro 18/1,5 ago da pollice, se i fluidi erano disponibili per l'aspirazione. Quindi tutti i 3 cc di soluzione tamponata di SVF sono stati iniettati lentamente nello spazio intrarticolare attraverso lo stesso calibro 18/1,5 ago in pollici. L'ago è stato quindi rimosso e la pressione diretta sul sito di iniezione è stata applicata per circa dieci (10) secondi. L'emostasi dopo l'iniezione è stata confermata, quindi il sito di iniezione è stato pulito con una salvietta imbevuta di alcol e coperto con un cerotto sterile. Al paziente sono state fornite le stampelle e gli è stato chiesto di non sostenere il peso sul ginocchio iniettato per due (2) giorni. Al paziente è stato permesso di piegare e flettere il ginocchio fintanto che viene mantenuta la condizione di non carico.

Metodi di valutazione del dolore e della mobilità. La valutazione del dolore al ginocchio è stata effettuata utilizzando gli strumenti per il dolore PROMIS, un sistema di scala del dolore convalidato sviluppato grazie al finanziamento del NIH. PROMIS (Patient Reported Outcomes Measurement Information System) è un sistema per misurare lo stato di salute riportato dal paziente per il benessere fisico, mentale e sociale, incluse tre misurazioni del dolore (www.nihpromis.org). Lo strumento PROMIS Pain Intensity (3a) valuta quanto fa male una persona. Lo strumento PROMIS Pain Behaviour (Bank 1.0) misura i comportamenti che indicano agli altri che un individuo sta provando dolore. Lo strumento PROMIS Pain Interference (Banca 1.0) misura le conseguenze del dolore su aspetti rilevanti della propria vita. Le risposte dei pazienti vengono convertite in valori numerici in una scala convalidata. Le risposte a ciascuna domanda in uno strumento del dolore vanno da 1 a 5 (1=per niente, 2=poco, 3=abbastanza, 4=abbastanza, 5=molto) e sono sommate al numero di domande in banca per creare un punteggio grezzo. Il punteggio grezzo viene convertito in un punteggio standardizzato utilizzando un metodo di risposta iterativo con una media di 50 e SD di 10, basato su un ampio campione della popolazione generale degli Stati Uniti. Le scale del dolore PROMIS convalidate forniscono dati sull'intervallo e consentono il calcolo della media e della SD e l'uso di t-test di significatività. I dati sono stati registrati prima dell'intervento (tempo 0) e nei punti di follow-up a 2 settimane, 4 settimane, 6 settimane e 12 settimane.

Inoltre ai pazienti è stato chiesto di rispondere a un questionario sul dolore e sulla mobilità con una domanda sul dolore e una domanda sulla mobilità. Il questionario chiedeva al paziente di confrontare il proprio aumento/diminuzione del dolore e della mobilità rispetto a prima dell'intervento chirurgico, utilizzando una scala ± 1-5, vedere la Figura 2. Su questa scala i numeri negativi corrispondono alla diminuzione del dolore/mobilità e i numeri positivi corrispondono all'aumento dolore/mobilità. Questo questionario fornisce dati ordinali e consente il calcolo della mediana e della significatività utilizzando il test non parametrico delle somme classificate di Wilcoxon.