Hormonální substituční terapie na postmenopauzálním endometriu

Předměty

Studie se zúčastní zdravé postmenopauzální ženy s amenoreou po dobu 1-10 let, ve věku 45-60 let a užívajícím folikuly stimulující hormon > 30 mili-mezinárodních jednotek/mililitrů (mIU/ml).

Všechny ženy budou informovány o studii a podepsané dokumenty o informovaném souhlasu, způsobilost byla stanovena na základě anamnézy a na základě celkového fyzického a gynekologického vyšetření. Všechny ženy byly lékařem informovány o rizicích a možných přínosech hormonální substituční terapie (HRT). Po zařazení byl proveden transvaginální ultrazvuk (TV-US), aby se vyhodnotila tloušťka endometria na začátku. Na konci studie bude provedena endometriální biopsie endometriálním vzorkovačem Pipelle k vyšetření histologických a imunohistochemických parametrů. Při screeningu budou také hodnoceny vitální funkce, krevní tlak, hmotnost, Pap stěr, mamografie, rutinní klinické chemické testy (včetně cholesterolu, cholesterolu s vysokou hustotou lipoproteinů, cholesterolu s nízkou hustotou, triglyceridů) a hematologie.

Léčebné skupiny Ze 100 původně hodnocených žen 32 nesplnilo kritéria pro zařazení a vyloučení, zatímco osm se odmítlo zúčastnit, což dává konečný celkový počet 60 pacientkám pro zařazení do studie. Šedesát postmenopauzálních žen bylo náhodně rozděleno do tří skupin: Skupina I: kontrolní skupina zahrnující 20 pacientek (bez hormonální léčby); Skupina II: také zahrnující 20 pacientek, kterým bude denně podávána kontinuální kombinovaná léčba drospirenonem 2 mg a 17p-estradiolem 1 mg (DRSP/E2); a skupina III: také zahrnující 20 pacientů, kterým bude denně podávána léčba tibolonem 1,25 mg (Tib). Všechny léčby budou podávány po dobu 24 týdnů. DRSP/E2 byl zakoupen od "Bayer Schering Pharma™", Brazílie a Tib od "Biolab™", Brazílie. Délka léčby bude 6 cyklů, z nichž každý bude trvat 28 dní (prováděno celkem 24 týdnů). Randomizace bude provedena pomocí počítačového softwaru, aby se předešlo zkreslení ve výběrovém řízení.

Cíl: Bude provedena prospektivní randomizovaná kontrolovaná studie s cílem vyhodnotit účinek nízké dávky tibolonu a estradiolu/drospirenonu na histologii, expresi estrogenových (ER) a progesteronových receptorů (PR) a Bcl-2 proteinu v endometriu postmenopauzálních žen .

Účinky na tloušťku endometria budou stanoveny pomocí transvaginálního ultrazvuku (TV-USG) na začátku studie a znovu po 6 cyklech léčby u všech účastnic. Skenování bylo prováděno pomocí skeneru v reálném čase, ultrazvukového systému "Hitachi 405" vybaveného vaginálním převodníkem 5,0 megahertzů (MHz) na "Univerzitě Vale do Sapucai". Tloušťka endometria < 4 milimetry (mm) bude interpretována jako nepodporující diagnózu karcinomu endometria.

Endometriální biopsie a odběr vzorků budou provedeny na konci léčebné kúry pomocí "Pipelle Curette" de Cornier, umístěné vysoko do horního fundu dělohy. Alikvotní část vzorku endometria se vytlačí z pipety do polypropylenové lahvičky. Lahvička bude uzavřena, okamžitě zmražena a poté uložena při -20 °C až do odeslání v suchém ledu na Ústav patologie na "Vale do Sapucai University", řízené jedním z autorů, pro měření gestagenového receptoru (PR). a receptory estrogenového receptoru (ER), stejně jako Bcl-2 protein. Zbývající endometriální tkáň se fixuje v 10% neutrálním pufrovaném formalínu po dobu 6-48 hodin a poté se zpracuje do parafínových bloků.

Histologické a imunohistochemické vyšetření Histologickou klasifikaci budou provádět dva patologové. Oba patologové provedou slepé čtení různých tkáňových řezů stejného blokového vzorku. Po obarvení hematoxylinem/eosinem a Schiffovou kyselinou periodickou (PAS) byl každý vzorek klasifikován do jedné z následujících kategorií: tkáň nedostatečná pro diagnózu, atrofické a/nebo inaktivní endometrium, proliferativní nebo slabě proliferativní endometrium a progestogenní.

Imunohistochemickou detekci Bcl-2 proteinu budou provádět dva patologové. Po získání antigenu a zablokování nespecifických míst normálním sérem za použití soupravy Avidin/Biotin Blocking kit (Vector Laboratories, Inc, Kalifornie, USA) budou řezy inkubovány přes noc při 4º Celsia s myší monoklonální protilátkou anti-Bcl-2 ( 1:100, Klon 124, DAKO, Dánsko). Protilátka vázaná na tkáň bude inkubována po dobu 30 minut při teplotě místnosti se systémem Envision. Barvení bude vizualizováno pomocí Envision (Kit N1587, DAKO, Dánsko). Vzorec buněčného barvení pro tuto protilátku je cytoplazmatický. Přítomnost ER a PR bude detekována, jak bylo popsáno dříve. Vzory buněčného barvení pro tyto protilátky jsou jaderné. Vzorek rakoviny prsu bude použit jako pozitivní kontrola pro steroidní receptory.

Vyšetření a fotografování bude prováděno pomocí světelného mikroskopu "Axioskop 40 - Zeiss" vybaveného digitálním fotoaparátem Canon™ D30 (Tokio, Japonsko) a video monitorem (LG 14" LCD) podle postupů Patologického oddělení ze Santa Casa of Sao. Paulo Medical School, Sao Paulo, Brazílie.

Morfometrická technika pro imunohistochemickou kvantifikaci bude provedena pomocí Neubauerovy odměrné komůrky. Skládá se ze skleněného podložního sklíčka, silnějšího než běžné podložní sklíčko, z nichž každé má mřížkový design rozdělující jej na čtverce se známými rozměry, vizualizované pouze optickým mikroskopem. Neubauerova počítací komora je rozdělena na 9 velkých čtverců, každý o straně 1 mm, pomocí trojitých čar (tedy plocha velkého čtverce = 1 mm²). Každý velký čtverec obsahuje 16 (4 x 4) středně velkých čtverců. Každý čtverec střední velikosti je dále rozdělen trojitými čarami na 25 (5 x 5) menších čtverců, každý o délce strany 1/5 mm. Plocha jednotlivého malého čtverce je tedy 0,05 x 0,05 mm = 0,0025 mm² a hloubka 0,1 mm.

Obraz pozorovaný přes čočky mikroskopu bude zachycen videokamerou a zobrazen na zvoleném monitoru. Neubauerova komůrka bude poté umístěna pod optický mikroskop s použitím objektivu, který zvětší původní velikost předmětu 400x nebo jakýmkoliv jiným zvětšením zvoleným výzkumníkem. Nakonec se oblast pod polem s velkým zvětšením (zvětšení 400x) odhadne v mm² spočítáním celkového počtu jednotlivých malých čtverečků 0,0025 mm² komory v rámci zvolené oblasti zvětšení. Celková plocha při velkém zvětšení odpovídala 0,094 mm².

Pomocí tohoto přístupu bude každý řez připravený imunohistochemickou metodou vyhodnocen pod světelným mikroskopem. Počet buněk ve studii bude počítán při 400násobném zvětšení. V různých hodnocených situacích bude provedeno počítání 10 polí. Průměrný počet buněk přítomných v tomto počtu 10 polí představoval plochu 0,094 mm². Pomocí jednoduchého pravidla tří bude počet buněk převeden na počty 1 mm². Počet buněk bude vyjádřen jako numerická hustota, tj. počet pozitivních buněk na čtvereční milimetr epitelu.

Počet Bcl-2-pozitivních buněk a imunoreaktivita pro expresi PR a ER budou kvantifikovány manuálně dvěma vyškolenými pozorovateli, kteří nejsou k experimentu zaslepeni, a vyhodnotí se samostatně pro glandulární a stromální buňky. Imunohistochemický index barvení (numerická hustota) bude definován jako průměrný počet pozitivních imunoexpresních buněk na mm², vypočítaný v 10 různých polích.

Statistická analýza Statistická analýza bude provedena pomocí "StatistiXL Package™" (Statistical Power for Microsoft Excel verze 1.8, 2007). Rozdíly v demografických parametrech, imunohistochemickém indexu barvení ER, PR a exprese proteinu Bcl-2 (numerická hustota), stejně jako výchozí tloušťka endometria a koncová hodnota léčby, budou analyzovány párovým Studentovým t-testem v různých skupinách. Vztahy mezi ER, PR a expresí proteinu Bcl-2 ve stromatu a glandulárním epitelu budou analyzovány pomocí Spearmanova testu.

Statistická významnost bude nastavena na p < 0,05. Data budou vyjádřena jako průměr + standardní odchylka (SD).