Terapia de reemplazo hormonal en el endometrio posmenopáusico

Asignaturas

Mujeres posmenopáusicas sanas, amenorreicas de 1 a 10 años, de 45 a 60 años de edad y en uso de hormona estimulante del folículo > 30 mil-Unidad internacional/mililitros (mUI/mL), participarán en el estudio.

Se informará a todas las mujeres sobre el ensayo y se firmarán los documentos de consentimiento informado; la elegibilidad se determinó en función de la historia clínica y del examen físico y ginecológico general. Todas las mujeres fueron informadas por un médico de los riesgos y posibles beneficios de la Terapia de Reemplazo Hormonal (TRH). Tras la inclusión, se realizó una ecografía transvaginal (TV-US) para evaluar el grosor del endometrio al inicio del estudio. Al final del estudio, se realizará una biopsia endometrial con un muestreador endometrial Pipelle para examinar los parámetros histológicos e inmunohistoquímicos. Los signos vitales, la presión arterial, el peso, la prueba de Papanicolaou, la mamografía, los análisis de química clínica de rutina (incluidos el colesterol, el colesterol de lipoproteínas de alta densidad, el colesterol de lipoproteínas de baja densidad, los triglicéridos) y la hematología también se evaluarán en la selección.

Grupos de Tratamiento De las 100 mujeres inicialmente evaluadas, 32 no cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión, mientras que ocho se negaron a participar, dando un total final de 60 pacientes para su inclusión en el estudio. Las sesenta mujeres posmenopáusicas fueron distribuidas aleatoriamente en tres grupos: Grupo I: grupo control compuesto por 20 pacientes (sin tratamiento hormonal); Grupo II: compuesto también por 20 pacientes, a los que se les administrará diariamente un tratamiento combinado continuo con drospirenona 2 mg y 17β-estradiol 1 mg (DRSP/E2); y Grupo III: compuesto también por 20 pacientes, a los que se les administrará tratamiento con tibolona 1,25 mg (Tib) diariamente. Todos los tratamientos se administrarán durante un período de 24 semanas. DRSP/E2 se adquirió de "Bayer Schering Pharma™", Brasil y Tib de "Biolab™", Brasil. La duración del tratamiento será de 6 ciclos, cada uno con una duración de 28 días (realizados durante un total de 24 semanas). La aleatorización se realizará con la ayuda de software informático para evitar sesgos en el proceso de selección.

Objetivo: Se llevará a cabo un ensayo prospectivo, aleatorizado y controlado para evaluar el efecto de dosis bajas de tibolona y estradiol/drospirenona sobre la histología, la expresión de los receptores de estrógeno (ER) y progesterona (PR) y la proteína Bcl-2, en el endometrio de mujeres posmenopáusicas. .

Los efectos sobre el grosor del endometrio se determinarán mediante ecografía transvaginal (TV-USG) al inicio del estudio y nuevamente después de 6 ciclos de tratamiento en todas las mujeres participantes. Los escaneos se realizaron con un escáner en tiempo real, sistema de ultrasonido "Hitachi 405", equipado con un transductor vaginal de 5,0 megahercios (MHz), en la "Universidad Vale do Sapucai". Un grosor endometrial < 4 milímetros (mm) se interpretará como que no respalda un diagnóstico de cáncer de endometrio.

La biopsia y el muestreo del endometrio se realizarán al final del ciclo de tratamiento utilizando una "Pipelle Curette" de Cornier, colocada en la parte superior del fondo del útero. Se empujará una alícuota de la muestra endometrial de la pipeta a un vial de polipropileno. El vial será tapado, inmediatamente congelado y luego almacenado a -20º Celsius hasta su envío en hielo seco al Departamento de Patología de la "Universidad Vale do Sapucai", dirigido por uno de los autores, para la medición del Receptor de Progestágeno (PR) y receptores del receptor de estrógeno (ER), así como la proteína Bcl-2. El tejido endometrial restante se fijará en formalina tamponada neutra al 10 % durante 6 a 48 horas y luego se procesará en bloques de parafina.

Valoración histológica e inmunohistoquímica La clasificación histológica la realizarán dos patólogos. Ambos patólogos harán una lectura a ciegas de diferentes secciones de tejido de la misma muestra en bloque. Después de la tinción con hematoxilina/eosina y ácido peryódico de Schiff (PAS), cada muestra se clasificó en una de las siguientes categorías: tejido insuficiente para el diagnóstico, endometrio atrófico y/o inactivo, endometrio proliferativo o débilmente proliferativo y progestágeno.

Dos patólogos realizarán la detección inmunohistoquímica de la proteína Bcl-2. Después de la recuperación del antígeno y el bloqueo de sitios no específicos con suero normal utilizando el kit de bloqueo de avidina/biotina (Vector Laboratories, Inc, California, EE. UU.), las secciones se incubarán durante la noche a 4 °C con anticuerpo monoclonal de ratón anti-Bcl-2 ( 1:100, Clon 124, DAKO, Dinamarca). El anticuerpo unido al tejido se incubará durante 30 minutos a temperatura ambiente con el sistema Envision. La tinción se visualizará mediante el uso de Envision (Kit N1587, DAKO, Dinamarca). El patrón de tinción celular para este anticuerpo es citoplasmático. La presencia de ER y PR se detectará como se describió anteriormente. Los patrones de tinción celular para estos anticuerpos son nucleares. Se utilizará una muestra de cáncer de mama como control positivo para los receptores de esteroides.

Los exámenes y la fotografía se realizarán utilizando un microscopio de luz "Axioskop 40 - Zeiss" equipado con una cámara digital Canon™ D30 (Tokio, Japón) y un monitor de video (LG 14 "LCD) de acuerdo con los procedimientos del Departamento de Patología de la Santa Casa de Sao Facultad de Medicina de Paulo, Sao Paulo, Brasil.

La técnica morfométrica para la cuantificación inmunohistoquímica se realizará con la ayuda de una cámara graduada de Neubauer. Este consiste en un portaobjetos de vidrio, más grueso que un portaobjetos normal, cada uno con un diseño de cuadrícula que lo divide en cuadrados de dimensiones conocidas, visualizados solo a través de un microscopio óptico. La cámara de recuento de Neubauer se divide en 9 cuadrados grandes, cada uno con lados de 1 mm, por medio de líneas triples (por lo tanto, el área de un cuadrado grande = 1 mm²). Cada cuadrado grande contiene 16 (4 x 4) cuadrados de tamaño mediano. Cada cuadrado de tamaño mediano se divide además por líneas triples en 25 (5 x 5) cuadrados más pequeños, cada uno con una longitud de lado de 1/5 de mm. Así, el área de un pequeño cuadrado individual es 0,05 x 0,05 mm = 0,0025 mm² y 0,1 mm de profundidad.

La imagen observada a través de las lentes del microscopio será capturada por la cámara de video y mostrada en el monitor elegido. Luego, la cámara de Neubauer se colocará bajo el microscopio óptico, utilizando un objetivo que aumenta el tamaño original del objeto en 400x o en cualquier otro aumento elegido por el investigador. Finalmente, el área bajo el campo de gran aumento (aumento de 400x) se estima en mm² contando el número total de pequeños cuadrados individuales de 0,0025 mm² de la cámara dentro del área de aumento elegida. El área total bajo gran aumento correspondió a 0,094 mm².

Usando este enfoque, cada sección preparada por el método inmunohistoquímico se evaluará bajo el microscopio óptico. El número de células en el estudio se contará con un aumento de 400x. Se realizará un conteo de 10 campos en las diferentes situaciones evaluadas. El número medio de células presentes en este recuento de 10 campos representó un área de 0,094 mm². Por medio de una simple regla de tres, el número de celdas se convertirá en conteos de 1 mm². El recuento de células se expresará como densidad numérica, es decir, número de células positivas por milímetro cuadrado de epitelio.

El número de células positivas para Bcl-2 y la inmunorreactividad para la expresión de PR y ER se cuantificarán manualmente por dos observadores entrenados, ciegos al experimento, y evaluarán por separado las células glandulares y estromales. El índice de tinción inmunohistoquímica (densidad numérica) se definirá como el número medio de células de inmunoexpresión positivas por mm², calculado en 10 campos diferentes.

Análisis estadístico El análisis estadístico se realizará utilizando el "StatistiXL Package™" (Statistical Power para Microsoft Excel versión 1.8, 2007). Las diferencias en los parámetros demográficos, el índice de tinción inmunohistoquímica de la expresión de la proteína ER, PR y Bcl-2 (densidad numérica), así como el grosor endometrial inicial y final del tratamiento, se analizarán mediante la prueba t de Student pareada en los diferentes grupos. Las relaciones entre la expresión de la proteína ER, PR y Bcl-2 en el estroma y el epitelio glandular se analizarán mediante la prueba de Spearman.

La significación estadística se establecerá en p < 0,05. Los datos se expresarán como media + desviación estándar (DE).