Hormonerstatningsterapi på det postmenopausale endometrium

Emner

Raske postmenopausale kvinder, amenorré i 1-10 år, i alderen 45-60 år og i brug af follikelstimulerende hormon > 30 mille-International enhed/milliliter (mIU/mL), vil deltage i undersøgelsen.

Alle kvinder vil blive informeret om forsøget og underskrevet de informerede samtykkedokumenter, berettigelse blev bestemt baseret på sygehistorie og på generel fysisk og gynækologisk undersøgelse. Alle kvinder blev informeret af en læge om risici og mulige fordele ved hormonbehandling (HRT). Efter inklusion blev transvaginal ultralyd (TV-US) udført for at evaluere tykkelsen af ​​endometriet ved baseline. Ved undersøgelsens slutpunkt vil der blive udført en endometriebiopsi med en Pipelle endometrieprøvetager for at undersøge histologiske og immunhistokemiske parametre. Vitale tegn, blodtryk, vægt, Pap-smear, mammografi, rutinemæssige kliniske kemiske assays (herunder kolesterol, højdensitetslipoproteinkolesterol, lavdensitetslipoproteinkolesterol, triglycerider) og hæmatologi vil også blive evalueret ved screening.

Behandlingsgrupper Af de 100 kvinder, der oprindeligt blev evalueret, opfyldte 32 ikke inklusions- og eksklusionskriterierne, mens otte nægtede at deltage, hvilket gav en endelig total på 60 patienter til inklusion i undersøgelsen. De tres postmenopausale kvinder blev tilfældigt fordelt i tre grupper: Gruppe I: kontrolgruppe omfattende 20 patienter (ingen hormonbehandling); Gruppe II: omfatter også 20 patienter, til hvem en kontinuerlig kombineret behandling med drospirenon 2 mg og 17β-estradiol 1 mg (DRSP/E2) vil blive administreret dagligt; og gruppe III: også omfattende 20 patienter, til hvem behandling med tibolon 1,25 mg (Tib) vil blive administreret dagligt. Alle behandlinger vil blive administreret i en 24-ugers periode. DRSP/E2 blev købt fra "Bayer Schering Pharma™", Brasilien og Tib fra "Biolab™", Brasilien. Behandlingens varighed vil være 6 cyklusser, hver af en periode på 28 dage (gennemført i i alt 24 uger). Randomisering vil ske ved hjælp af computersoftware for at forhindre skævhed i udvælgelsesprocessen.

Formål: Et prospektivt randomiseret kontrolleret forsøg vil blive udført for at evaluere effekten af ​​lav dosis tibolon og østradiol/drospirenon på histologien, ekspressionen af ​​østrogen (ER) og progesteronreceptorer (PR) og Bcl-2-protein i endometrium hos postmenopausale kvinder .

Virkningerne på endometrietykkelse vil blive bestemt ved transvaginal ultralyd (TV-USG) ved undersøgelsens baseline og igen efter 6 behandlingscyklusser hos alle kvindelige deltagere. Scanninger blev udført med en realtidsscanner, "Hitachi 405" ultralydssystem udstyret med en 5,0 megahertz (MHz) vaginal transducer, på "Vale do Sapucai University". En endometrietykkelse < 4 millimeter (mm) vil blive fortolket som ikke at understøtte en diagnose af endometriecancer.

Endometriebiopsi og prøveudtagning vil blive udført i slutningen af ​​behandlingsforløbet ved hjælp af en "Pipelle Curette" de Cornier, placeret højt ind i den øvre fundus af livmoderen. En alikvot af endometrieprøven skubbes fra pipetten ind i et polypropylenhætteglas. Hætteglasset vil blive lukket, straks frosset og derefter opbevaret ved -20º Celsius indtil forsendelse i tøris til Institut for Patologi ved "Vale do Sapucai University", instrueret af en af ​​forfatterne, til måling af gestagenreceptor (PR) og østrogenreceptor (ER)-receptorer samt Bcl-2-protein. Det resterende endometrievæv fikseres i 10 % neutralt bufret formalin i 6-48 timer og behandles derefter til paraffinblokke.

Histologisk og immunhistokemisk vurdering Histologisk klassificering vil blive udført af to patologer. Begge patologer vil foretage en blind aflæsning af forskellige vævssnit af den samme blokprøve. Efter farvning med hæmatoxylin/eosin og Schiff Periodic Acid (PAS) blev hver prøve klassificeret i en af ​​følgende kategorier: væv utilstrækkeligt til diagnose, atrofisk og/eller inaktivt endometrium, proliferativt eller svagt proliferativt endometrium og progestogent .

Immunhistokemisk påvisning af Bcl-2-protein vil blive udført af to patologer. Efter antigenudvinding og blokering af ikke-specifikke steder med normalt serum ved hjælp af Avidin/Biotin Blocking kit (Vector Laboratories, Inc, Californien, USA), vil sektionerne blive inkuberet natten over ved 4º Celsius med anti-Bcl-2 muse monoklonalt antistof ( 1:100, Clone 124, DAKO, Danmark). Det vævsbundne antistof vil blive inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med Envision-systemet. Farvning vil blive visualiseret ved brug af Envision (Kit N1587, DAKO, Danmark). Det cellulære farvningsmønster for dette antistof er cytoplasmatisk. Tilstedeværelsen af ​​ER og PR vil blive detekteret som beskrevet tidligere. De cellulære farvningsmønstre for disse antistoffer er nukleare. En brystkræftprøve vil blive brugt som en positiv kontrol for steroidreceptorerne.

Undersøgelser og fotografering vil blive udført ved hjælp af et "Axioskop 40 - Zeiss" lysmikroskop udstyret med et Canon™ D30 digitalkamera (Tokyo, Japan) og videomonitor (LG 14" LCD) i henhold til procedurerne fra patologiafdelingen fra Santa Casa i Sao Paulo Medical School, Sao Paulo, Brasilien.

Den morfometriske teknik til immunhistokemi kvantificering vil blive udført ved hjælp af et Neubauer gradueret kammer. Dette består af et objektglas, tykkere end et almindeligt objektglas, som hver har et gitterdesign, der deler det op i firkanter med kendte dimensioner, kun visualiseret gennem et optisk mikroskop. Neubauer-tællekammeret er opdelt i 9 store firkanter, hver med 1 mm sider, ved hjælp af tredobbelte linjer (altså areal af en stor firkant = 1 mm²). Hver stor firkant indeholder 16 (4 x 4) mellemstore firkanter. Hver mellemstor firkant er yderligere opdelt med tredobbelte linjer i 25 (5 x 5) mindre firkanter, hver med en sidelængde på 1/5 mm. Således er arealet af en individuel lille firkant 0,05 x 0,05 mm = 0,0025 mm² og 0,1 mm dyb.

Billedet observeret gennem mikroskoplinserne vil blive fanget af videokameraet og vist på den valgte skærm. Neubauer-kammeret vil derefter blive placeret under det optiske mikroskop ved hjælp af et objektiv, der forstørrer objektets oprindelige størrelse med 400x eller med en anden forstørrelse valgt af forskeren. Endelig estimeres arealet under det høje forstørrelsesfelt (400x forstørrelse) i mm² ved at tælle det samlede antal individuelle små 0,0025 mm² kvadrater af kammeret inden for det valgte forstørrelsesområde. Det samlede areal under høj forstørrelse svarede til 0,094 mm².

Ved hjælp af denne tilgang vil hver sektion, der er fremstillet ved den immunhistokemiske metode, blive evalueret under lysmikroskopet. Antallet af celler i undersøgelsen vil blive talt ved 400x forstørrelse. En 10-felttælling vil blive udført i de forskellige evaluerede situationer. Det gennemsnitlige antal celler til stede i denne 10-feltstælling repræsenterede et areal på 0,094 mm². Ved hjælp af en simpel treregel omregnes antallet af celler til 1 mm² tællinger. Celletallet vil blive udtrykt som numerisk tæthed, dvs. antal positive celler pr. kvadratmillimeter epitel.

Antallet af Bcl-2-positive celler og immunreaktivitet for PR- og ER-ekspression vil kvantificeres manuelt af to trænede observatører, blinde for eksperimentet, og vil evaluere separat for kirtel- og stromaceller. Det immunhistokemiske farvningsindeks (numerisk tæthed) vil blive defineret som det gennemsnitlige antal positive immunekspressionsceller pr. mm², beregnet i 10 forskellige felter.

Statistisk analyse Statistisk analyse vil blive udført ved hjælp af "StatistiXL Package™" (Statistical Power for Microsoft Excel version 1.8, 2007). Forskelle i demografiske parametre, immunhistokemisk farvningsindeks for ER-, PR- og Bcl-2-proteinekspression (numerisk tæthed) samt baseline og end-point endometrietykkelse for behandlingen vil blive analyseret ved den parrede Students t-test i de forskellige grupper. Forholdet mellem ER, PR og Bcl-2-proteinekspression i stroma og kirtelepitel vil blive analyseret ved hjælp af Spearmans test.

Statistisk signifikans vil blive sat til p < 0,05. Data vil udtrykkes som middelværdi + standardafvigelse (SD).