Hormonersatztherapie am postmenopausalen Endometrium

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An der Studie werden gesunde postmenopausale Frauen teilnehmen, die seit 1–10 Jahren amenorrhoisch sind, im Alter von 45–60 Jahren und follikelstimulierendes Hormon > 30 Mille – Internationale Einheit/Milliliter (mIU/ml) einnehmen.

Alle Frauen werden über die Studie informiert und haben die Einverständniserklärung unterzeichnet, die Eignung wurde auf der Grundlage der Krankengeschichte und der allgemeinen körperlichen und gynäkologischen Untersuchung festgestellt. Alle Frauen wurden von einem Arzt über die Risiken und möglichen Vorteile der Hormonersatztherapie (HRT) aufgeklärt. Nach der Aufnahme wurde ein transvaginaler Ultraschall (TV-US) durchgeführt, um die Dicke des Endometriums zu Studienbeginn zu beurteilen. Am Studienende wird eine Endometriumbiopsie mit einem Endometriumprobenentnahmegerät von Pipelle durchgeführt, um histologische und immunhistochemische Parameter zu untersuchen. Vitalfunktionen, Blutdruck, Gewicht, Pap-Abstrich, Mammographie, routinemäßige klinisch-chemische Tests (einschließlich Cholesterin, High-Density-Lipoprotein-Cholesterin, Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin, Triglyceride) und Hämatologie werden ebenfalls beim Screening bewertet.

Behandlungsgruppen Von den 100 anfänglich bewerteten Frauen erfüllten 32 die Einschluss- und Ausschlusskriterien nicht, während acht die Teilnahme verweigerten, was eine endgültige Gesamtzahl von 60 Patienten für die Aufnahme in die Studie ergibt. Die sechzig postmenopausalen Frauen wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe I: Kontrollgruppe mit 20 Patientinnen (keine Hormonbehandlung); Gruppe II: umfasst ebenfalls 20 Patienten, denen eine kontinuierliche kombinierte Behandlung mit Drospirenon 2 mg und 17β-Estradiol 1 mg (DRSP/E2) täglich verabreicht wird; und Gruppe III: umfasst ebenfalls 20 Patienten, denen täglich eine Behandlung mit Tibolon 1,25 mg (Tib) verabreicht wird. Alle Behandlungen werden über einen Zeitraum von 24 Wochen durchgeführt. DRSP/E2 wurde von "Bayer Schering Pharma™", Brasilien, und Tib von "Biolab™", Brasilien, bezogen. Die Dauer der Behandlung beträgt 6 Zyklen von jeweils 28 Tagen (Durchführung insgesamt 24 Wochen). Die Randomisierung erfolgt mit Hilfe von Computersoftware, um Verzerrungen im Auswahlverfahren zu vermeiden.

Ziel: Es wird eine prospektive randomisierte kontrollierte Studie durchgeführt, um die Wirkung einer niedrigen Dosis von Tibolon und Estradiol/Drospirenon auf die Histologie, die Expression von Östrogen- (ER) und Progesteronrezeptoren (PR) und das Bcl-2-Protein im Endometrium von postmenopausalen Frauen zu bewerten .

Die Auswirkungen auf die Dicke des Endometriums werden durch transvaginalen Ultraschall (TV-USG) zu Studienbeginn und erneut nach 6 Behandlungszyklen bei allen weiblichen Teilnehmern bestimmt. Die Scans wurden mit einem Echtzeit-Scanner, dem „Hitachi 405“-Ultraschallsystem, ausgestattet mit einem 5,0-Megahertz (MHz)-Vaginalwandler, an der „Vale do Sapucai University“ durchgeführt. Eine Endometriumdicke < 4 Millimeter (mm) wird so interpretiert, dass sie die Diagnose eines Endometriumkarzinoms nicht unterstützt.

Endometriumbiopsie und Entnahme werden am Ende des Behandlungszyklus mit einer "Pipelle Curette" de Cornier durchgeführt, die hoch in den oberen Fundus der Gebärmutter eingeführt wird. Ein Aliquot der Endometriumprobe wird aus der Pipette in ein Polypropylenfläschchen gedrückt. Das Fläschchen wird verschlossen, sofort eingefroren und dann bei -20 °C gelagert, bis es in Trockeneis an die von einem der Autoren geleitete Abteilung für Pathologie der "Vale do Sapucai University" zur Messung des Gestagenrezeptors (PR) versandt wird. und Östrogenrezeptor (ER)-Rezeptoren sowie Bcl-2-Protein. Das verbleibende Endometriumgewebe wird in 10 % neutral gepuffertem Formalin für 6–48 h fixiert und dann zu Paraffinblöcken verarbeitet.

Histologische und immunhistochemische Beurteilung Die histologische Einordnung erfolgt durch zwei Pathologen. Beide Pathologen führen eine Blindablesung verschiedener Gewebeschnitte derselben Blockprobe durch. Nach Färbung mit Hämatoxylin/Eosin und Schiffsperjodsäure (PAS) wurde jede Probe in eine der folgenden Kategorien eingeteilt: Gewebe unzureichend für die Diagnose, atrophisches und/oder inaktives Endometrium, proliferatives oder schwach proliferatives Endometrium und progestogen.

Der immunhistochemische Nachweis des Bcl-2-Proteins wird von zwei Pathologen durchgeführt. Nach der Antigengewinnung und Blockierung unspezifischer Stellen mit normalem Serum unter Verwendung des Avidin/Biotin-Blockierungskits (Vector Laboratories, Inc, Kalifornien, USA) werden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit monoklonalem Anti-Bcl-2-Maus-Antikörper inkubiert ( 1:100, Clone 124, DAKO, Dänemark). Der gewebegebundene Antikörper wird für 30 min bei Raumtemperatur mit dem Envision System inkubiert. Die Färbung wird mithilfe von Envision (Kit N1587, DAKO, Dänemark) visualisiert. Das zelluläre Färbemuster für diesen Antikörper ist zytoplasmatisch. Das Vorhandensein von ER und PR wird wie zuvor beschrieben erfasst. Die zellulären Färbemuster für diese Antikörper sind nukleär. Eine Brustkrebsprobe wird als Positivkontrolle für die Steroidrezeptoren verwendet.

Untersuchungen und Fotografie werden unter Verwendung eines "Axioskop 40 - Zeiss" Lichtmikroskops, ausgestattet mit einer Canon™ D30 Digitalkamera (Tokio, Japan) und einem Videomonitor (LG 14" LCD) gemäß den Verfahren der Abteilung für Pathologie von Santa Casa of Sao durchgeführt Paulo Medical School, Sao Paulo, Brasilien.

Die morphometrische Technik zur immunhistochemischen Quantifizierung wird mit Hilfe einer Neubauer-Messkammer durchgeführt. Diese besteht aus einem Objektträger aus Glas, der dicker als ein normaler Objektträger ist und jeweils ein Gittermuster aufweist, das ihn in Quadrate mit bekannten Abmessungen unterteilt, die nur durch ein optisches Mikroskop sichtbar gemacht werden. Die Neubauer-Zählkammer ist durch Dreifachlinien in 9 große Quadrate mit je 1 mm Seitenlänge unterteilt (also Fläche eines großen Quadrats = 1 mm²). Jedes große Quadrat enthält 16 (4 x 4) mittelgroße Quadrate. Jedes mittelgroße Quadrat ist weiter durch dreifache Linien in 25 (5 x 5) kleinere Quadrate unterteilt, jedes mit einer Seitenlänge von 1/5 mm. Somit ist die Fläche eines einzelnen kleinen Quadrats 0,05 x 0,05 mm = 0,0025 mm² und 0,1 mm tief.

Das durch die Mikroskoplinsen beobachtete Bild wird von der Videokamera erfasst und auf dem ausgewählten Monitor angezeigt. Die Neubauer-Kammer wird dann unter dem optischen Mikroskop platziert, wobei ein Objektiv verwendet wird, das die ursprüngliche Größe des Objekts um das 400-fache oder durch eine andere vom Forscher gewählte Vergrößerung vergrößert. Schließlich wird die Fläche unter dem starken Vergrößerungsfeld (400-fache Vergrößerung) in mm² geschätzt, indem die Gesamtzahl der einzelnen kleinen 0,0025-mm²-Quadrate der Kammer innerhalb des gewählten Vergrößerungsbereichs gezählt werden. Die Gesamtfläche bei starker Vergrößerung entsprach 0,094 mm².

Bei diesem Ansatz wird jeder immunhistochemisch hergestellte Schnitt unter dem Lichtmikroskop ausgewertet. Die Anzahl der Zellen in der Studie wird bei 400-facher Vergrößerung gezählt. In den verschiedenen bewerteten Situationen wird eine 10-Felder-Zählung durchgeführt. Die durchschnittliche Anzahl der in dieser 10-Felder-Zählung vorhandenen Zellen repräsentierte eine Fläche von 0,094 mm². Mit einem einfachen Dreisatz wird die Zellenzahl in 1 mm²-Zählungen umgerechnet. Die Zellzahl wird als numerische Dichte ausgedrückt, d. h. Anzahl positiver Zellen pro Quadratmillimeter Epithel.

Die Anzahl der Bcl-2-positiven Zellen und die Immunreaktivität für die PR- und ER-Expression werden manuell von zwei geschulten Beobachtern quantifiziert, die für das Experiment blind sind, und werden getrennt für Drüsen- und Stromazellen bewertet. Der immunhistochemische Färbeindex (numerische Dichte) wird definiert als die mittlere Anzahl positiver Immunexpressionszellen pro mm², berechnet in 10 verschiedenen Feldern.

Statistische Analyse Die statistische Analyse wird mit dem „StatistiXL Package™“ (Statistical Power for Microsoft Excel Version 1.8, 2007) durchgeführt. Unterschiede in den demografischen Parametern, dem immunhistochemischen Färbeindex der ER-, PR- und Bcl-2-Proteinexpression (numerische Dichte) sowie der Ausgangs- und Behandlungsendpunkt der Endometriumdicke werden durch den gepaarten Student's t-Test in den verschiedenen Gruppen analysiert. Die Beziehungen zwischen ER, PR und Bcl-2-Proteinexpression in Stroma und Drüsenepithel werden mit dem Spearman-Test analysiert.

Die statistische Signifikanz wird auf p < 0,05 eingestellt. Die Daten werden als Mittelwert + Standardabweichung (SD) ausgedrückt.