Hormoonsubstitutietherapie op het postmenopauzale endometrium

onderwerpen

Gezonde postmenopauzale vrouwen, amenorroe voor 1-10 jaar, in de leeftijd van 45-60 jaar en in gebruik van follikelstimulerend hormoon > 30 mille-Internationale eenheid/milliliter (mIU/mL), zullen deelnemen aan het onderzoek.

Alle vrouwen zullen worden geïnformeerd over het onderzoek en de geïnformeerde toestemmingsdocumenten moeten worden ondertekend. Geschiktheid werd bepaald op basis van medische geschiedenis en algemeen lichamelijk en gynaecologisch onderzoek. Alle vrouwen werden door een arts geïnformeerd over de risico's en mogelijke voordelen van hormoonsubstitutietherapie (HST). Na opname werd transvaginale echografie (TV-US) uitgevoerd om de dikte van het endometrium bij baseline te evalueren. Op het eindpunt van de studie zal een endometriumbiopsie worden uitgevoerd met een Pipelle endometriummonsternemer om histologische en immunohistochemische parameters te onderzoeken. Vitale functies, bloeddruk, gewicht, uitstrijkje, mammografie, routinematige klinische chemie-assays (waaronder cholesterol, lipoproteïne-cholesterol met hoge dichtheid, lipoproteïne-cholesterol met lage dichtheid, triglyceriden) en hematologie zullen ook bij de screening worden beoordeeld.

Behandelingsgroepen Van de 100 vrouwen die aanvankelijk werden geëvalueerd, voldeden er 32 niet aan de inclusie- en exclusiecriteria, terwijl acht weigerden deel te nemen, wat een totaal van 60 patiënten opleverde voor opname in het onderzoek. De zestig postmenopauzale vrouwen werden willekeurig ingedeeld in drie groepen: Groep I: controlegroep bestaande uit 20 patiënten (geen hormonale behandeling); Groep II: eveneens bestaande uit 20 patiënten, aan wie dagelijks een continue gecombineerde behandeling met drospirenon 2 mg en 17β-oestradiol 1 mg (DRSP/E2) zal worden gegeven; en Groep III: eveneens bestaande uit 20 patiënten, aan wie dagelijks een behandeling met tibolon 1,25 mg (Tib) zal worden toegediend. Alle behandelingen worden gegeven voor een periode van 24 weken. DRSP/E2 werd gekocht van "Bayer Schering Pharma™", Brazilië en Tib van "Biolab™", Brazilië. De duur van de behandeling is 6 cycli, die elk een periode van 28 dagen duren (uitgevoerd gedurende in totaal 24 weken). Randomisatie vindt plaats met behulp van computersoftware om bias in het selectieproces te voorkomen.

Doelstelling: Er zal een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde studie worden uitgevoerd om het effect van een lage dosis tibolon en oestradiol/drospirenon op de histologie, expressie van oestrogeen- (ER) en progesteronreceptoren (PR) en Bcl-2-eiwit in het endometrium van postmenopauzale vrouwen te evalueren. .

De effecten op de dikte van het endometrium zullen worden bepaald door middel van transvaginale echografie (TV-USG) aan het begin van de studie en opnieuw na 6 behandelingscycli bij alle vrouwelijke deelnemers. Scans werden uitgevoerd met een real-time scanner, "Hitachi 405" echografiesysteem uitgerust met een 5,0-megahertz (MHz) vaginale transducer, aan de "Vale do Sapucai University". Een dikte van het endometrium < 4 millimeter (mm) wordt geïnterpreteerd als een ondersteuning van een diagnose van endometriumkanker.

Endometriumbiopsie en bemonstering zullen worden uitgevoerd aan het einde van de behandelingskuur met behulp van een "Pipelle Curette" de Cornier, hoog in de bovenste fundus van de baarmoeder geplaatst. Een aliquot van het endometriummonster wordt uit de pipet in een polypropyleen flesje geduwd. De injectieflacon wordt afgesloten, onmiddellijk ingevroren en vervolgens bewaard bij -20º Celsius tot verzending in droogijs naar de afdeling Pathologie van de "Vale do Sapucai University", geregisseerd door een van de auteurs, voor meting van de progestageenreceptor (PR) en oestrogeenreceptor (ER) -receptoren evenals Bcl-2-eiwit. Het resterende endometriumweefsel fixeert zich gedurende 6-48 uur in 10% neutraal gebufferde formaline en wordt vervolgens verwerkt tot paraffineblokken.

Histologische en immunohistochemische beoordeling Histologische classificatie zal worden uitgevoerd door twee pathologen. Beide pathologen zullen verschillende weefselsecties van hetzelfde blokmonster blind lezen. Na kleuring met hematoxyline/eosine en Schiff Periodic Acid (PAS) werd elk monster geclassificeerd in een van de volgende categorieën: weefsel onvoldoende voor diagnose, atrofisch en/of inactief endometrium, proliferatief of zwak proliferatief endometrium en progestogeen.

Immunohistochemische detectie van Bcl-2-eiwit zal worden uitgevoerd door twee pathologen. Na het ophalen van antigeen en het blokkeren van niet-specifieke plaatsen met normaal serum met behulp van de Avidin/Biotin Blocking-kit (Vector Laboratories, Inc, Californië, VS), zullen de coupes een nacht bij 4º Celsius worden geïncubeerd met anti-Bcl-2 muis monoklonaal antilichaam ( 1:100, Clone 124, DAKO, Denemarken). Het weefselgebonden antilichaam wordt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met het Envision-systeem. Kleuring wordt gevisualiseerd met behulp van Envision (Kit N1587, DAKO, Denemarken). Het cellulaire kleuringspatroon voor dit antilichaam is cytoplasmatisch. De aanwezigheid van ER en PR zal worden gedetecteerd zoals eerder beschreven. De cellulaire kleuringspatronen voor deze antilichamen zijn nucleair. Een monster van borstkanker zal worden gebruikt als een positieve controle voor de steroïdereceptoren.

Onderzoeken en fotografie worden uitgevoerd met behulp van een "Axioskop 40 - Zeiss" lichtmicroscoop uitgerust met een Canon™ D30 digitale camera (Tokio, Japan) en videomonitor (LG 14" LCD) volgens de procedures van de afdeling Pathologie van Santa Casa of Sao Paulo Medical School, Sao Paulo, Brazilië.

De morfometrische techniek voor immunohistochemische kwantificering zal uitgevoerd worden met behulp van een Neubauer gegradueerde kamer. Dit bestaat uit een glazen objectglaasje, dikker dan een gewoon objectglaasje, elk met een rasterontwerp dat het verdeelt in vierkanten met bekende afmetingen, alleen gevisualiseerd door een optische microscoop. De telkamer van Neubauer is verdeeld in 9 grote vierkanten, elk met 1 mm zijden, door middel van driedubbele lijnen (dus oppervlakte van een groot vierkant = 1 mm²). Elk groot vierkant bevat 16 (4 x 4) middelgrote vierkanten. Elk middelgroot vierkant is verder verdeeld door drievoudige lijnen in 25 (5 x 5) kleinere vierkanten, elk met een zijdelengte van 1/5 mm. De oppervlakte van een individueel vierkantje is dus 0,05 x 0,05 mm= 0,0025 mm² en 0,1 mm diep.

Het beeld dat door de microscooplenzen wordt waargenomen, wordt door de videocamera vastgelegd en op de gekozen monitor weergegeven. De Neubauer-kamer wordt vervolgens onder de optische microscoop geplaatst, met behulp van een objectief dat de oorspronkelijke grootte van het object vergroot met 400x of met een andere vergroting gekozen door de onderzoeker. Ten slotte wordt het gebied onder het sterke vergrotingsveld (400x vergroting) geschat in mm² door het totale aantal individuele kleine vierkantjes van 0,0025 mm² van de kamer binnen het gekozen vergrotingsgebied te tellen. Het totale gebied onder sterke vergroting kwam overeen met 0,094 mm².

Met behulp van deze benadering zal elke coupe die met de immunohistochemische methode is bereid, onder de lichtmicroscoop worden geëvalueerd. Het aantal cellen in het onderzoek wordt geteld bij een vergroting van 400x. Er wordt een telling van 10 velden uitgevoerd in de verschillende beoordeelde situaties. Het gemiddelde aantal cellen dat aanwezig was in deze telling van 10 velden vertegenwoordigde een oppervlakte van 0,094 mm². Door middel van een simpele regel van drie wordt het aantal cellen omgerekend naar 1 mm² counts. Het aantal cellen wordt uitgedrukt als numerieke dichtheid, d.w.z. het aantal positieve cellen per vierkante millimeter epitheel.

Het aantal Bcl-2-positieve cellen en immunoreactiviteit voor PR- en ER-expressie zullen handmatig worden gekwantificeerd door twee getrainde waarnemers, blind voor het experiment, en zullen afzonderlijk worden geëvalueerd voor glandulaire en stromale cellen. De immunohistochemische kleuringsindex (numerieke dichtheid) wordt gedefinieerd als het gemiddelde aantal positieve immuno-expressiecellen per mm², berekend in 10 verschillende velden.

Statistische analyse Statistische analyse wordt uitgevoerd met behulp van het "StatistiXL Package™" (Statistical Power voor Microsoft Excel versie 1.8, 2007). Verschillen in demografische parameters, immunohistochemische kleuringsindex van ER-, PR- en Bcl-2-eiwitexpressie (numerieke dichtheid), evenals de endometriumdikte van het basislijn- en eindpunt van de behandeling, zullen worden geanalyseerd door de gepaarde Student's t-test in de verschillende groepen. De relaties tussen ER-, PR- en Bcl-2-eiwitexpressie in stroma en glandulair epitheel zullen worden geanalyseerd met behulp van Spearman's test.

Statistische significantie wordt ingesteld op p < 0,05. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde + standaarddeviatie (SD).