Terapia ormonale sostitutiva sull'endometrio postmenopausale

Soggetti

Parteciperanno allo studio donne sane in postmenopausa, amenorroiche da 1 a 10 anni, di età compresa tra 45 e 60 anni e in uso di ormone follicolo-stimolante > 30 mille unità internazionali/millilitri (mIU/mL).

Tutte le donne saranno informate della sperimentazione e firmate i documenti di consenso informato, l'idoneità è stata determinata sulla base dell'anamnesi e dell'esame fisico e ginecologico generale. Tutte le donne sono state informate da un medico dei rischi e dei possibili benefici della terapia ormonale sostitutiva (HRT). Dopo l'inclusione, è stata eseguita l'ecografia transvaginale (TV-US) per valutare lo spessore dell'endometrio al basale. All'endpoint dello studio, verrà eseguita una biopsia endometriale con un campionatore endometriale Pipelle per esaminare i parametri istologici e immunoistochimici. Allo screening verranno valutati anche segni vitali, pressione sanguigna, peso, Pap test, mammografia, analisi di chimica clinica di routine (inclusi colesterolo, colesterolo lipoproteico ad alta densità, colesterolo lipoproteico a bassa densità, trigliceridi) ed ematologia.

Gruppi di trattamento Delle 100 donne inizialmente valutate, 32 non hanno soddisfatto i criteri di inclusione ed esclusione, mentre otto si sono rifiutate di partecipare, per un totale finale di 60 pazienti da includere nello studio. Le sessanta donne in postmenopausa sono state assegnate casualmente in tre gruppi: Gruppo I: gruppo di controllo comprendente 20 pazienti (nessun trattamento ormonale); Gruppo II: comprendente anche 20 pazienti, ai quali verrà somministrato giornalmente un trattamento combinato continuo con drospirenone 2 mg e 17β-estradiolo 1 mg (DRSP/E2); e Gruppo III: comprendente anch'esso 20 pazienti, ai quali verrà somministrato giornalmente il trattamento con tibolone 1,25 mg (Tib). Tutti i trattamenti saranno somministrati per un periodo di 24 settimane. DRSP/E2 è stato acquistato da "Bayer Schering Pharma™", Brasile e Tib da "Biolab™", Brasile. La durata del trattamento sarà di 6 cicli, ciascuno della durata di 28 giorni (svolti per un totale di 24 settimane). La randomizzazione sarà effettuata con l'ausilio di software per computer al fine di evitare distorsioni nel processo di selezione.

Obiettivo: Verrà condotto uno studio prospettico randomizzato controllato per valutare l'effetto di una bassa dose di tibolone ed estradiolo/drospirenone sull'istologia, l'espressione dei recettori degli estrogeni (ER) e del progesterone (PR) e della proteina Bcl-2, nell'endometrio delle donne in postmenopausa .

Gli effetti sullo spessore endometriale saranno determinati dall'ecografia transvaginale (TV-USG) al basale dello studio e di nuovo dopo 6 cicli di trattamento in tutte le donne partecipanti. Le scansioni sono state eseguite con uno scanner in tempo reale, il sistema a ultrasuoni "Hitachi 405" dotato di un trasduttore vaginale da 5,0 megahertz (MHz), presso la "Vale do Sapucai University". Uno spessore endometriale <4 millimetri (mm) sarà interpretato come non a supporto di una diagnosi di cancro dell'endometrio.

La biopsia e il prelievo endometriale verranno eseguiti alla fine del ciclo di trattamento utilizzando una "Pipelle Curette" de Cornier, posizionata in alto nel fondo superiore dell'utero. Un'aliquota del campione endometriale verrà spinta dalla pipetta in una fiala di polipropilene. La fiala verrà tappata, immediatamente congelata e quindi conservata a -20º Celsius fino alla spedizione in ghiaccio secco al Dipartimento di Patologia dell'Università "Vale do Sapucai", diretto da uno degli autori, per la misurazione del recettore del progestinico (PR) e recettori del recettore degli estrogeni (ER) così come la proteina Bcl-2. Il restante tessuto endometriale si fisserà in formalina tamponata neutra al 10% per 6-48 ore e quindi si trasformerà in blocchi di paraffina.

Valutazione istologica e immunoistochimica La classificazione istologica sarà effettuata da due patologi. Entrambi i patologi eseguiranno una lettura alla cieca di diverse sezioni di tessuto dello stesso blocco-campione. Dopo la colorazione con ematossilina/eosina e acido periodico di Schiff (PAS), ciascun campione è stato classificato in una delle seguenti categorie: tessuto insufficiente per la diagnosi, endometrio atrofico e/o inattivo, endometrio proliferativo o debolmente proliferativo e progestinico.

Il rilevamento immunoistochimico della proteina Bcl-2 sarà eseguito da due patologi. Dopo il recupero dell'antigene e il blocco di siti non specifici con siero normale utilizzando il kit Avidin/Biotin Blocking (Vector Laboratories, Inc, California, USA), le sezioni saranno incubate durante la notte a 4º Celsius con anticorpo monoclonale di topo anti-Bcl-2 ( 1:100, Clone 124, DAKO, Danimarca). L'anticorpo legato al tessuto verrà incubato per 30 minuti a temperatura ambiente con il sistema Envision. La colorazione sarà visualizzata mediante l'uso di Envision (Kit N1587, DAKO, Danimarca). Il pattern di colorazione cellulare per questo anticorpo è citoplasmatico. La presenza di ER e PR verrà rilevata come descritto in precedenza. I modelli di colorazione cellulare per questi anticorpi sono nucleari. Un campione di cancro al seno verrà utilizzato come controllo positivo per i recettori degli steroidi.

Gli esami e la fotografia verranno eseguiti utilizzando un microscopio ottico "Axioskop 40 - Zeiss" dotato di fotocamera digitale Canon™ D30 (Tokyo, Giappone) e monitor video (LG 14" LCD) secondo le procedure del Dipartimento di Patologia della Santa Casa di Sao Paulo Medical School, San Paolo, Brasile.

La tecnica morfometrica per la quantificazione immunoistochimica sarà eseguita con l'ausilio di una camera graduata di Neubauer. Consiste in un vetrino, più spesso di un normale vetrino, ciascuno con un disegno a griglia che lo divide in quadrati di dimensioni note, visualizzati solo attraverso un microscopio ottico. La camera contaglobuli di Neubauer è suddivisa in 9 grandi quadrati, ciascuno di 1 mm di lato, mediante linee triple (quindi area di un grande quadrato = 1 mm²). Ogni quadrato grande contiene 16 (4 x 4) quadrati di medie dimensioni. Ogni quadrato di medie dimensioni è ulteriormente suddiviso da linee triple in 25 (5 x 5) quadrati più piccoli, ciascuno con una lunghezza laterale di 1/5 di mm. Pertanto, l'area di un singolo quadratino è 0,05 x 0,05 mm= 0,0025 mm² e 0,1 mm di profondità.

L'immagine osservata attraverso le lenti del microscopio verrà catturata dalla telecamera e visualizzata sul monitor prescelto. La camera di Neubauer sarà quindi posta sotto il microscopio ottico, utilizzando un obiettivo che ingrandisca la dimensione originale dell'oggetto di 400x o di qualsiasi altro ingrandimento scelto dal ricercatore. Infine, l'area sotto il campo ad alto ingrandimento (ingrandimento 400x) è stimata in mm² contando il numero totale di piccoli quadrati individuali di 0,0025 mm² della camera all'interno dell'area di ingrandimento scelta. L'area totale ad alto ingrandimento corrispondeva a 0,094 mm².

Utilizzando questo approccio, ogni sezione preparata con il metodo immunoistochimico sarà valutata al microscopio ottico. Il numero di cellule nello studio sarà contato a 400 ingrandimenti. Verrà eseguito un conteggio di 10 campi nelle diverse situazioni valutate. Il numero medio di celle presenti in questo conteggio di 10 campi rappresentava un'area di 0,094 mm². Per mezzo di una semplice regola del tre, il numero di celle verrà convertito in conteggi di 1 mm². La conta cellulare sarà espressa come densità numerica, cioè numero di cellule positive per millimetro quadrato di epitelio.

Il numero di cellule Bcl-2-positive e l'immunoreattività per l'espressione di PR e ER saranno quantificati manualmente da due osservatori addestrati, ciechi all'esperimento, e valuteranno separatamente per le cellule ghiandolari e stromali. L'indice di colorazione immunoistochimica (densità numerica) sarà definito come il numero medio di cellule immunoespressive positive per mm², calcolato in 10 diversi campi.

Analisi statistica L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando lo "StatistiXL Package™" (Statistical Power per Microsoft Excel versione 1.8, 2007). Le differenze nei parametri demografici, nell'indice di colorazione immunoistochimica dell'espressione della proteina ER, PR e Bcl-2 (densità numerica), così come lo spessore endometriale al basale e all'endpoint del trattamento, saranno analizzate dal t-test di Student appaiato nei diversi gruppi. Le relazioni tra ER, PR e l'espressione della proteina Bcl-2 nello stroma e nell'epitelio ghiandolare saranno analizzate mediante il test di Spearman.

La significatività statistica sarà fissata a p <0,05. I dati saranno espressi come media + deviazione standard (DS).