Hormonalna terapia zastępcza endometrium pomenopauzalnego

Przedmioty

W badaniu wezmą udział zdrowe kobiety po menopauzie, które nie miesiączkują od 1 do 10 lat, w wieku 45-60 lat i stosują hormon folikulotropowy > 30 mililitrów jednostek międzynarodowych (mIU/ml).

Wszystkie kobiety zostaną poinformowane o badaniu i podpisane dokumenty świadomej zgody, kwalifikacja została określona na podstawie historii choroby oraz ogólnego badania fizykalnego i ginekologicznego. Wszystkie kobiety zostały poinformowane przez lekarza o ryzyku i możliwych korzyściach związanych z hormonalną terapią zastępczą (HTZ). Po włączeniu wykonano ultrasonografię przezpochwową (TV-US) w celu oceny wyjściowej grubości endometrium. W punkcie końcowym badania zostanie przeprowadzona biopsja endometrium za pomocą próbnika endometrium Pipelle w celu zbadania parametrów histologicznych i immunohistochemicznych. Parametry życiowe, ciśnienie krwi, waga, badanie cytologiczne, mammografia, rutynowe kliniczne testy chemiczne (w tym cholesterol, cholesterol lipoprotein o wysokiej gęstości, cholesterol lipoprotein o niskiej gęstości, trójglicerydy) oraz hematologia zostaną również ocenione podczas badań przesiewowych.

Grupy terapeutyczne Spośród 100 wstępnie ocenianych kobiet 32 ​​nie spełniało kryteriów włączenia i wyłączenia, podczas gdy osiem odmówiło udziału, co daje ostatecznie 60 pacjentek do włączenia do badania. Sześćdziesiąt kobiet po menopauzie losowo przydzielono do trzech grup: Grupa I: grupa kontrolna składająca się z 20 pacjentek (bez leczenia hormonalnego); Grupa II: również obejmująca 20 pacjentów, u których codziennie będzie podawane ciągłe leczenie skojarzone drospirenonem 2 mg i 17β-estradiolem 1 mg (DRSP/E2); oraz Grupa III: również obejmująca 20 pacjentów, którym codziennie będzie podawane leczenie tibolonem w dawce 1,25 mg (Tib). Wszystkie zabiegi będą podawane przez okres 24 tygodni. DRSP/E2 zakupiono od „Bayer Schering Pharma™”, Brazylia, a Tib od „Biolab™”, Brazylia. Czas trwania kuracji wyniesie 6 cykli, z których każdy będzie trwał 28 dni (łącznie 24 tygodnie). Randomizacja zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania komputerowego, aby zapobiec stronniczości w procesie selekcji.

Cel: Prospektywne randomizowane badanie kontrolowane zostanie przeprowadzone w celu oceny wpływu małej dawki tibolonu i estradiolu/drospirenonu na histologię, ekspresję receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR) oraz białka Bcl-2 w endometrium kobiet po menopauzie .

Wpływ na grubość endometrium zostanie określony za pomocą ultrasonografii przezpochwowej (TV-USG) na początku badania i ponownie po 6 cyklach leczenia u wszystkich uczestniczek. Skany przeprowadzono za pomocą skanera działającego w czasie rzeczywistym, systemu ultrasonograficznego „Hitachi 405” wyposażonego w przetwornik dopochwowy 5,0 megaherców (MHz), na Uniwersytecie „Vale do Sapucai”. Grubość endometrium < 4 milimetry (mm) będzie interpretowana jako nie wspierająca rozpoznania raka endometrium.

Pod koniec cyklu leczenia zostanie przeprowadzona biopsja endometrium i pobranie próbek za pomocą „Pipelle Curette” de Cornier, umieszczonej wysoko w górnym dnie macicy. Porcja próbki endometrium zostanie wypchnięta z pipety do fiolki polipropylenowej. Fiolka zostanie zakorkowana, natychmiast zamrożona, a następnie przechowywana w temperaturze -20°C do czasu wysyłki w suchym lodzie do Wydziału Patologii Uniwersytetu „Vale do Sapucai”, kierowanego przez jednego z autorów, w celu pomiaru receptora progestagenowego (PR) i receptorów estrogenowych (ER) oraz białka Bcl-2. Pozostała tkanka endometrium zostanie utrwalona w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 6-48 godzin, a następnie przetworzona na bloczki parafinowe.

Ocena histologiczna i immunohistochemiczna Klasyfikacja histologiczna zostanie przeprowadzona przez dwóch patologów. Obaj patolodzy dokonają ślepego odczytu różnych skrawków tkanki tej samej próbki blokowej. Po wybarwieniu hematoksyliną/eozyną i kwasem nadjodowym Schiffa (PAS), każdą próbkę klasyfikowano do jednej z następujących kategorii: tkanka niewystarczająca do postawienia diagnozy, endometrium zanikowe i/lub nieaktywne, endometrium proliferujące lub słabo proliferujące oraz progestagenne.

Immunohistochemiczne wykrywanie białka Bcl-2 wykona dwóch patologów. Po odzyskaniu antygenu i zablokowaniu niespecyficznych miejsc normalną surowicą przy użyciu zestawu Avidin/Biotin Blocking kit (Vector Laboratories, Inc, Kalifornia, USA), skrawki będą inkubowane przez noc w temperaturze 4°C z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-Bcl-2 ( 1:100, Clone 124, DAKO, Dania). Przeciwciało związane z tkanką będzie inkubowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej z systemem Envision. Barwienie będzie wizualizowane przy użyciu Envision (zestaw N1587, DAKO, Dania). Wzór barwienia komórkowego dla tego przeciwciała jest cytoplazmatyczny. Obecność ER i PR zostanie wykryta w sposób opisany wcześniej. Wzory barwienia komórkowego dla tych przeciwciał są jądrowe. Próbka raka piersi zostanie użyta jako kontrola pozytywna dla receptorów steroidowych.

Badania i zdjęcia będą wykonywane przy użyciu mikroskopu świetlnego "Axioskop 40 - Zeiss" wyposażonego w aparat cyfrowy Canon™ D30 (Tokio, Japonia) i monitor wideo (LG 14" LCD) zgodnie z procedurami Zakładu Patologii z Santa Casa of Sao Paulo Medical School, Sao Paulo, Brazylia.

Morfometryczna technika kwantyfikacji immunohistochemicznej zostanie przeprowadzona za pomocą komory z podziałką Neubauera. Składa się ze szklanego szkiełka, grubszego niż zwykłe szkiełka, z których każdy ma wzór siatki dzielący go na kwadraty o znanych wymiarach, widoczne tylko pod mikroskopem optycznym. Komora zliczeniowa Neubauera jest podzielona potrójnymi liniami na 9 dużych kwadratów, każdy o boku 1 mm (tak więc pole dużego kwadratu = 1 mm²). Każdy duży kwadrat zawiera 16 (4 x 4) średnich kwadratów. Każdy średniej wielkości kwadrat jest dodatkowo podzielony potrójnymi liniami na 25 (5 x 5) mniejszych kwadratów, każdy o długości boku 1/5 mm. Zatem pole pojedynczego małego kwadratu wynosi 0,05 x 0,05 mm = 0,0025 mm² i głębokość 0,1 mm.

Obraz obserwowany przez soczewki mikroskopu zostanie zarejestrowany przez kamerę wideo i wyświetlony na wybranym monitorze. Następnie komora Neubauera zostanie umieszczona pod mikroskopem optycznym, przy użyciu obiektywu, który powiększa pierwotny rozmiar obiektu 400x lub o dowolne inne powiększenie wybrane przez badacza. Ostatecznie obszar pod polem o dużym powiększeniu (powiększenie 400x) szacuje się w mm² przez zliczenie całkowitej liczby pojedynczych małych kwadratów 0,0025 mm² komory w wybranym obszarze powiększenia. Całkowity obszar pod dużym powiększeniem odpowiadał 0,094 mm².

Stosując to podejście, każdy skrawek przygotowany metodą immunohistochemiczną będzie oceniany pod mikroskopem świetlnym. Liczba komórek w badaniu zostanie zliczona przy 400-krotnym powiększeniu. W różnych ocenianych sytuacjach zostanie przeliczone 10 pól. Średnia liczba komórek obecnych w tym 10-polowym zliczeniu reprezentowała powierzchnię 0,094 mm2. Za pomocą prostej reguły trzech liczba ogniw zostanie przeliczona na 1 mm². Liczba komórek zostanie wyrażona jako gęstość liczbowa, tj. liczba komórek dodatnich na milimetr kwadratowy nabłonka.

Liczba komórek Bcl-2-dodatnich i immunoreaktywność dla ekspresji PR i ER zostaną określone ilościowo ręcznie przez dwóch przeszkolonych obserwatorów, ślepych na eksperyment, i zostaną ocenione oddzielnie dla komórek gruczołowych i zrębowych. Wskaźnik barwienia immunohistochemicznego (gęstość liczbowa) zostanie zdefiniowany jako średnia liczba dodatnich komórek immunoekspresyjnych na mm², obliczona w 10 różnych polach.

Analiza statystyczna Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu „StatistiXL Package™” (Statistical Power for Microsoft Excel wersja 1.8, 2007). Różnice w parametrach demograficznych, wskaźniku barwienia immunohistochemicznego ekspresji białek ER, PR i Bcl-2 (gęstość liczbowa), jak również wyjściowej i końcowej grubości endometrium zostaną przeanalizowane za pomocą sparowanego testu t-Studenta w różnych grupach. Zależności między ekspresją białek ER, PR i Bcl-2 w zrębie i nabłonku gruczołowym będą analizowane za pomocą testu Spearmana.

Istotność statystyczna zostanie ustalona na poziomie p < 0,05. Dane wyrażą się jako średnia + odchylenie standardowe (SD).