Terapia de Reposição Hormonal no Endométrio Pós-Menopáusico

assuntos

Participarão do estudo mulheres saudáveis ​​na pós-menopausa, amenorréicas de 1 a 10 anos, com idade entre 45 e 60 anos e em uso de hormônio folículo estimulante > 30 mil unidades internacionais/mililitros (mIU/mL).

Todas as mulheres serão informadas sobre o estudo e assinaram os documentos de consentimento informado. A elegibilidade foi determinada com base no histórico médico e no exame físico e ginecológico geral. Todas as mulheres foram informadas por um médico sobre os riscos e possíveis benefícios da terapia de reposição hormonal (TRH). Após a inclusão, foi realizada ultrassonografia transvaginal (TV-US) para avaliar a espessura do endométrio na linha de base. No ponto final do estudo, uma biópsia endometrial será realizada com um amostrador de endométrio Pipelle para examinar os parâmetros histológicos e imuno-histoquímicos. Sinais vitais, pressão arterial, peso, exame de Papanicolaou, mamografia, ensaios de química clínica de rotina (incluindo colesterol, colesterol de lipoproteína de alta densidade, colesterol de lipoproteína de baixa densidade, triglicerídeos) e hematologia também serão avaliados na triagem.

Grupos de tratamento Das 100 mulheres inicialmente avaliadas, 32 não atenderam aos critérios de inclusão e exclusão, enquanto oito se recusaram a participar, totalizando 60 pacientes para inclusão no estudo. As sessenta mulheres na pós-menopausa foram alocadas aleatoriamente em três grupos: Grupo I: grupo controle composto por 20 pacientes (sem tratamento hormonal); Grupo II: também composto por 20 pacientes, aos quais será administrado diariamente um tratamento combinado contínuo com drospirenona 2 mg e 17β-estradiol 1 mg (DRSP/E2); e Grupo III: também composto por 20 pacientes, aos quais será administrado tratamento com tibolona 1,25 mg (Tib) diariamente. Todos os tratamentos serão administrados por um período de 24 semanas. O DRSP/E2 foi adquirido da "Bayer Schering Pharma™", Brasil e o Tib da "Biolab™", Brasil. A duração do tratamento será de 6 ciclos, cada um com duração de 28 dias (realizados em um total de 24 semanas). A randomização será feita com o auxílio de software de computador para evitar viés no processo de seleção.

Objetivo: Será realizado um ensaio prospectivo randomizado controlado para avaliar o efeito de baixa dose de tibolona e estradiol/drospirenona na histologia, expressão de receptores de estrogênio (ER) e progesterona (PR) e proteína Bcl-2, no endométrio de mulheres na pós-menopausa .

Os efeitos sobre a espessura endometrial serão determinados por Ultrassom Transvaginal (TV-USG) no início do estudo e novamente após 6 ciclos de tratamento em todas as mulheres participantes. Os exames foram realizados com um scanner em tempo real, sistema de ultrassom "Hitachi 405" equipado com um transdutor vaginal de 5,0 megahertz (MHz), na "Universidade Vale do Sapucaí". Uma espessura endometrial < 4 milímetros (mm) será interpretada como não corroborando o diagnóstico de câncer endometrial.

A biópsia endometrial e a amostragem serão realizadas no final do curso de tratamento usando uma "Pipelle Curette" de Cornier, colocada no fundo superior do útero. Uma alíquota da amostra endometrial será empurrada da pipeta para um frasco de polipropileno. O frasco será tampado, imediatamente congelado e armazenado a -20º Celsius até o envio em gelo seco ao Departamento de Patologia da "Universidade do Vale do Sapucaí", orientado por um dos autores, para dosagem do Receptor de Progestágeno (PR) e receptores de receptor de estrogênio (ER), bem como proteína Bcl-2. O tecido endometrial restante será fixado em formalina tamponada neutra a 10% por 6 a 48 h e depois processado em blocos de parafina.

Avaliação histológica e imunohistoquímica A classificação histológica será realizada por dois patologistas. Ambos os patologistas farão uma leitura cega de diferentes seções de tecido da mesma amostra em bloco. Após coloração com hematoxilina/eosina e ácido periódico de Schiff (PAS), cada espécime foi classificado em uma das seguintes categorias: tecido insuficiente para diagnóstico, endométrio atrófico e/ou inativo, endométrio proliferativo ou pouco proliferativo e progestogênico.

A detecção imuno-histoquímica da proteína Bcl-2 será realizada por dois patologistas. Após recuperação antigênica e bloqueio de sítios inespecíficos com soro normal utilizando o kit Avidin/Biotin Blocking (Vector Laboratories, Inc, Califórnia, EUA), os cortes serão incubados durante a noite a 4º Celsius com anticorpo monoclonal de camundongo anti-Bcl-2 ( 1:100, Clone 124, DAKO, Dinamarca). O anticorpo ligado ao tecido será incubado por 30 min em temperatura ambiente com o Sistema Envision. A coloração será visualizada com o Envision (Kit N1587, DAKO, Dinamarca). O padrão de coloração celular para este anticorpo é citoplasmático. A presença de ER e PR será detectada conforme descrito anteriormente. Os padrões de coloração celular para esses anticorpos são nucleares. Uma amostra de câncer de mama será usada como controle positivo para os receptores de esteroides.

Os exames e as fotografias serão realizados em microscópio de luz "Axioskop 40 - Zeiss" equipado com câmera digital Canon™ D30 (Tóquio, Japão) e monitor de vídeo (LG 14" LCD) de acordo com os procedimentos do Departamento de Patologia da Santa Casa de São Escola Paulista de Medicina, São Paulo, Brasil.

A técnica morfométrica para quantificação imuno-histoquímica será realizada com auxílio de câmara graduada de Neubauer. Este consiste em uma lâmina de vidro, mais espessa que uma lâmina normal, cada uma com um desenho de grade que a divide em quadrados de dimensões conhecidas, visualizados apenas através de um microscópio óptico. A câmara de contagem de Neubauer é dividida em 9 quadrados grandes, cada um com 1 mm de lado, por meio de linhas triplas (portanto, a área de um quadrado grande = 1 mm²). Cada quadrado grande contém 16 (4 x 4) quadrados de tamanho médio. Cada quadrado de tamanho médio é ainda dividido por linhas triplas em 25 (5 x 5) quadrados menores, cada um com um comprimento lateral de 1/5 de mm. Assim, a área de um pequeno quadrado individual é 0,05 x 0,05 mm = 0,0025 mm² e 0,1 mm de profundidade.

A imagem observada pelas lentes do microscópio será captada pela câmera de vídeo e exibida no monitor escolhido. A câmara de Neubauer será então colocada sob o microscópio óptico, utilizando-se uma objetiva que aumente o tamanho original do objeto em 400x ou por qualquer outra ampliação escolhida pelo pesquisador. Finalmente, a área sob o campo de alta ampliação (ampliação de 400x) é estimada em mm² contando o número total de pequenos quadrados individuais de 0,0025 mm² da câmara dentro da área de ampliação escolhida. A área total sob grande aumento correspondeu a 0,094 mm².

Com essa abordagem, cada corte preparado pelo método imuno-histoquímico será avaliado ao microscópio de luz. O número de células no estudo será contado com ampliação de 400x. Será realizada uma contagem de 10 campos nas diferentes situações avaliadas. O número médio de células presentes nesta contagem de 10 campos representou uma área de 0,094 mm². Por meio de uma regra de três simples, o número de células será convertido em contagens de 1 mm². A contagem de células será expressa como densidade numérica, ou seja, número de células positivas por milímetro quadrado de epitélio.

O número de células Bcl-2-positivas e a imunorreatividade para expressão de PR e ER serão quantificados manualmente por dois observadores treinados, cegos para o experimento, e serão avaliados separadamente para células glandulares e estromais. O índice de coloração imuno-histoquímica (densidade numérica) será definido como o número médio de células imunoexpressivas positivas por mm², calculado em 10 campos diferentes.

Análise estatística A análise estatística será realizada utilizando o "StatistiXL Package™" (Statistical Power for Microsoft Excel versão 1.8, 2007). Diferenças nos parâmetros demográficos, índice de coloração imuno-histoquímica de expressão de proteínas ER, PR e Bcl-2 (densidade numérica), bem como espessura endometrial inicial e final do tratamento, serão analisadas pelo teste t de Student pareado nos diferentes grupos. As relações entre a expressão das proteínas ER, PR e Bcl-2 no estroma e no epitélio glandular serão analisadas pelo teste de Spearman.

A significância estatística será estabelecida em p < 0,05. Os dados serão expressos como média + desvio padrão (DP).