Заместительная гормональная терапия эндометрия в постменопаузе

Предметы

В исследовании примут участие здоровые женщины в постменопаузе, страдающие аменореей в течение 1-10 лет, в возрасте 45-60 лет и принимающие фолликулостимулирующий гормон > 30 милли-Международных единиц/миллилитров (мМЕ/мл).

Все женщины будут проинформированы об испытании и подпишут документы об информированном согласии, право на участие в которых будет определено на основании истории болезни, общего физического и гинекологического осмотра. Все женщины были проинформированы врачом о рисках и возможных преимуществах заместительной гормональной терапии (ЗГТ). После включения было выполнено трансвагинальное УЗИ (ТВ-УЗИ) для оценки толщины эндометрия на исходном уровне. В конечной точке исследования будет выполнена биопсия эндометрия с помощью эндометриального пробоотборника Pipelle для изучения гистологических и иммуногистохимических параметров. При скрининге также будут оцениваться основные показатели жизнедеятельности, кровяное давление, вес, мазок Папаниколау, маммография, рутинные биохимические анализы (включая холестерин, холестерин липопротеинов высокой плотности, холестерин липопротеинов низкой плотности, триглицериды) и гематология.

Группы лечения Из 100 первоначально оцененных женщин 32 не соответствовали критериям включения и исключения, а восемь отказались от участия, в результате чего в исследование было включено в общей сложности 60 пациенток. Шестьдесят женщин в постменопаузе были случайным образом распределены на три группы: группа I: контрольная группа, состоящая из 20 пациенток (без гормонального лечения); Группа II: также включает 20 пациентов, которым ежедневно будет назначаться непрерывная комбинированная терапия дроспиреноном 2 мг и 17β-эстрадиолом 1 мг (DRSP/E2); и группа III: также включает 20 пациентов, которым ежедневно будет вводиться лечение тиболоном 1,25 мг (Tib). Все процедуры будут проводиться в течение 24 недель. DRSP/E2 был приобретен у «Bayer Schering Pharma™», Бразилия, а Tib у «Biolab™», Бразилия. Продолжительность лечения составит 6 циклов, каждый продолжительностью 28 дней (в общей сложности проводится 24 недели). Рандомизация будет проводиться с помощью компьютерного программного обеспечения, чтобы предотвратить систематическую ошибку в процессе отбора.

Цель: будет проведено проспективное рандомизированное контролируемое исследование для оценки влияния низких доз тиболона и эстрадиола/дроспиренона на гистологию, экспрессию рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) и белка Bcl-2 в эндометрии женщин в постменопаузе. .

Влияние на толщину эндометрия будет определяться трансвагинальным ультразвуковым исследованием (TV-USG) в начале исследования и снова после 6 циклов лечения у всех женщин-участниц. Сканирование проводилось с помощью сканера в реальном времени, ультразвуковой системы «Hitachi 405», оснащенной вагинальным преобразователем 5,0 мегагерц (МГц), в «Университете Вале до Сапукай». Толщина эндометрия < 4 миллиметров (мм) будет интерпретироваться как не подтверждающая диагноз рака эндометрия.

Биопсия и забор эндометрия будут выполнены в конце курса лечения с помощью «Pipelle Curette» de Cornier, помещенного высоко в верхнюю часть дна матки. Аликвоту образца эндометрия переносят из пипетки в полипропиленовый флакон. Флакон будет закрыт крышкой, немедленно заморожен, а затем сохранен при температуре -20º по Цельсию до отправки в сухом льду в отделение патологии в «Университете Вале до Сапукай» под руководством одного из авторов для измерения рецептора прогестагена (PR). и рецепторы рецептора эстрогена (ER), а также белок Bcl-2. Оставшуюся ткань эндометрия фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине на 6-48 часов, а затем перерабатывают в парафиновые блоки.

Гистологическая и иммуногистохимическая оценка Гистологическую классификацию будут проводить два патологоанатома. Оба патологоанатома проведут слепое чтение различных участков ткани одного и того же блока-образца. После окрашивания гематоксилином/эозином и периодической кислотой Шиффа (ПАШ) каждый образец был отнесен к одной из следующих категорий: ткань, недостаточная для диагностики, атрофический и/или неактивный эндометрий, пролиферативный или слабопролиферативный эндометрий и прогестагенный.

Иммуногистохимическое определение белка Bcl-2 будет проводиться двумя патологами. После извлечения антигена и блокирования неспецифических участков нормальной сывороткой с использованием набора для блокирования авидина/биотина (Vector Laboratories, Inc, Калифорния, США) срезы инкубируют в течение ночи при 4°С с мышиным моноклональным антителом против Bcl-2 ( 1:100, Clone 124, DAKO, Дания). Связанное с тканью антитело будет инкубироваться в течение 30 минут при комнатной температуре с помощью системы Envision. Окрашивание визуализируют с помощью Envision (Kit N1587, DAKO, Дания). Паттерн клеточного окрашивания для этого антитела является цитоплазматическим. Наличие ER и PR будет обнаружено, как описано ранее. Паттерны клеточного окрашивания для этих антител являются ядерными. Образец рака молочной железы будет использоваться в качестве положительного контроля для стероидных рецепторов.

Обследования и фотосъемка будут проводиться с использованием светового микроскопа "Axioskop 40 - Zeiss", оснащенного цифровой камерой Canon™ D30 (Токио, Япония) и видеомонитором (LG 14" LCD) в соответствии с процедурами отделения патологии Санта-Каса-ди-Сан. Медицинская школа Пауло, Сан-Паулу, Бразилия.

Морфометрический метод количественного определения иммуногистохимии будет выполняться с помощью градуированной камеры Нойбауэра. Он состоит из предметного стекла, более толстого, чем обычное предметное стекло, каждое из которых имеет сетку, делящую его на квадраты с известными размерами, визуализируемые только через оптический микроскоп. Счетная камера Нойбауэра разделена тройными линиями на 9 больших квадратов со стороной 1 мм каждый (таким образом, площадь большого квадрата = 1 мм²). Каждый большой квадрат содержит 16 (4 х 4) квадратов среднего размера. Каждый квадрат среднего размера далее разделен тройными линиями на 25 (5 х 5) меньших квадратов, каждый со стороной 1/5 мм. Таким образом, площадь отдельного квадратика составляет 0,05 х 0,05 мм = 0,0025 мм² и 0,1 мм в глубину.

Изображение, наблюдаемое через линзы микроскопа, будет захвачено видеокамерой и отображено на выбранном мониторе. Затем камеру Нойбауэра помещают под оптический микроскоп с использованием объектива, который увеличивает первоначальный размер объекта в 400 раз или с любым другим увеличением, выбранным исследователем. Наконец, площадь под полем большого увеличения (400-кратное увеличение) оценивается в мм² путем подсчета общего количества отдельных маленьких квадратов 0,0025 мм² камеры в пределах выбранной области увеличения. Общая площадь при большом увеличении соответствовала 0,094 мм².

При таком подходе каждый срез, приготовленный иммуногистохимическим методом, будет оцениваться под световым микроскопом. Количество клеток в исследовании будет подсчитано при 400-кратном увеличении. В различных оцениваемых ситуациях будет проводиться подсчет по 10 полям. Среднее количество клеток, присутствующих в этом подсчете по 10 полям, представляло собой площадь 0,094 мм². С помощью простого правила трех количество клеток будет преобразовано в 1 мм². Количество клеток будет выражаться числовой плотностью, т.е. количеством положительных клеток на квадратный миллиметр эпителия.

Количество Bcl-2-позитивных клеток и иммунореактивность в отношении экспрессии PR и ER будут количественно определены вручную двумя обученными наблюдателями, слепыми к эксперименту, и будут оцениваться отдельно для железистых и стромальных клеток. Индекс иммуногистохимического окрашивания (числовая плотность) будет определяться как среднее количество положительных иммуноэкспрессирующих клеток на мм², рассчитанное в 10 различных полях.

Статистический анализ Статистический анализ будет выполняться с использованием "StatistiXL Package™" (Statistical Power for Microsoft Excel, версия 1.8, 2007 г.). Различия в демографических параметрах, индексе иммуногистохимического окрашивания экспрессии белка ER, PR и Bcl-2 (численная плотность), а также толщина эндометрия в исходном и конечном состоянии будут проанализированы с помощью парного t-критерия Стьюдента в разных группах. Отношения между экспрессией белка ER, PR и Bcl-2 в строме и железистом эпителии будут проанализированы с использованием теста Спирмена.

Статистическая значимость будет установлена ​​на уровне p < 0,05. Данные будут выражаться как среднее + стандартное отклонение (SD).