Diverzita a složení mikrobioty a biologická dostupnost polyfenolů

Výzkumníci navrhují provést randomizovanou, kontrolovanou, zkříženou studii u 10 dospělých, kteří mají pravidelnou stolici (≥ 5x/týden) a jsou ochotni konzumovat stravu bez rostlinných potravin. Zkouška bude zahrnovat dvě 5denní intervenční fáze s dvoutýdenním vymývacím obdobím mezi přechody. Během intervenčních fází bude subjektům poskytnuto veškeré stravování. Subjekty budou náhodně rozděleny tak, aby dostávaly buď Con nebo FWCP dietu obsahující 30 gramů shodného placeba nebo FWCP. Dávka je zvolena tak, aby poskytla dostatečné množství flavonoidů a PAC, které může být srovnatelné s průměrným příjmem flavonoidů a PAC při 157 mg a 95 mg/den v USA. Strava bez rostlinné potravy bude sestavena tak, aby obsahovala pouze složky živočišného původu. Všechna jídla budou navržena a pod dohledem Helen Rasmussen, PhD, RD, a budou připravována v kuchyni Metabolic Research Unit. Balená mražená jídla budou poskytnuta subjektům ke konzumaci doma nebo v práci. Káva, čaj a další rostlinné nápoje nebudou během intervenčních fází povoleny.

Všichni jedinci budou muset před zařazením do studie poskytnout svůj informovaný souhlas. Jednotlivci budou testováni na způsobilost ke studii podle vylučovacích kritérií, jak následuje: 1) 3 měsíce před studií nebyly podány žádné antibiotické léky nebo léky, o nichž je známo, že ovlivňují fekální mikrobiotu; 2) aktivní léčba onemocnění diagnostikovaných lékařem, jako je rakovina, kardiovaskulární onemocnění, gastrointestinální onemocnění; 3) pravidelné užívání jakýchkoli doplňků stravy; 4) kolonoskopie 2 měsíce před jejich zařazením nebo naplánovaná během studie; 5) hodnoty standardních biochemických vyšetření krve jsou kriticky abnormální na základě uvážení lékaře studie; a 6) užívání ≥14/týdenní porce alkoholu. Subjekty, které splňují všechna ostatní kritéria způsobilosti a mají hodnoty biochemie krve v normálních rozmezích, budou požádány o účast ve studii.

Během studie budou způsobilí jedinci muset absolvovat 1 screeningovou návštěvu a 9 studijních návštěv v průběhu 5-7 týdnů. Na konci návštěv 2 a 6 dostanou subjekty náhodně přidělená zmrazená jídla a začnou konzumovat studovaná jídla po dobu 5 dnů. Subjekty mohou konzumovat studované jídlo ≥ 5 da, dokud není odebrán vzorek stolice po intervenci. Celý vzorek stolice bude umístěn do uzavřeného sáčku a následně do chladiče s ledovými obklady a do 24 hodin převezen na MRU. Ranní bodová moč a 30 ml krve nalačno, stejně jako všechna další klinická data, budou shromážděny před a po každé intervenční fázi. Všechny odebrané vzorky budou až do použití skladovány při -80 °C.

Velikost vzorku studie na lidech byla odhadnuta na základě účinku FWCP na rostlinnou stravou bez stravy vyvolané zvýšení bakterií tolerantních ke žluči a na zvýšení Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta a Blautia coccoides-Eubacterium rectale. Vzhledem k tomu, že v literatuře nejsou k dispozici žádné údaje, které by ilustrovaly účinek FWCP na bakterie tolerantní ke žluči pro výpočet síly, vědci použijí v navrhované křížové řízené studii krmení 10 subjektů k testování naší hypotézy.

Fekální DNA bude extrahována enzymatickým štěpením a narážením kuliček s následným použitím QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen). Amplikony genu 16S rRNA budou generovány z extrahované DNA pomocí PCR se sadou primerů s čárovým kódem cíleným na variabilní oblast V4. Amplikony budou sekvenovány na Illumina ® MiSeq Sequencer v centru Tufts University Core Facility, které řídí Dr. Anne Kane. Analýza mikrobioty bude provedena pomocí Qiime v 1.7. Provozní taxonomické jednotky budou generovány pomocí UClust. Parametry diverzity alfa a beta budou vypočteny pomocí Qiime. Flavonoidy a fenolové kyseliny v moči budou stanoveny naší rutinní HPLC-elektrochemickou detekční metodou. Anthokyaniny a jejich glukuronidátové metabolity v moči budou kvantifikovány LC-MS/MS testem, který výzkumníci běžně používají. Fekální mastné kyseliny s krátkým řetězcem budou stanoveny metodou GC-MS, která byla zavedena v naší laboratoři. Hodnota pH ve fekální vodě stolice bude stanovena pomocí pH metru po odstředění. Jednotlivé žlučové kyseliny ve stolici budou stanoveny pomocí metody LC-QTOF-MS. TMA ve stolici bude stanovena pomocí spektrofotometrického testu.