Diversität und Zusammensetzung von Mikrobiota und Polyphenol-Bioverfügbarkeit

Die Forscher schlagen vor, eine randomisierte Crossover-Studie mit kontrollierter Ernährung bei 10 Erwachsenen durchzuführen, die regelmäßig Stuhlgang haben (≥ 5-mal/Woche) und bereit sind, sich pflanzlich zu ernähren. Die Studie umfasst zwei 5-tägige Interventionsphasen mit einer 2-wöchigen Auswaschphase zwischen den Übergängen. Alle Mahlzeiten werden den Probanden während der Interventionsphasen zur Verfügung gestellt. Die Probanden erhalten nach dem Zufallsprinzip entweder eine Con- oder eine FWCP-Diät, die 30 Gramm passendes Placebo oder FWCP enthält. Die Dosis wird so gewählt, dass ausreichende Mengen an Flavonoid und PAC bereitgestellt werden, die mit der durchschnittlichen Flavonoid- und PAC-Aufnahme von 157 mg bzw. 95 mg/Tag in den USA vergleichbar sind. Die pflanzennahrungsfreie Diät wird so formuliert, dass sie nur Zutaten tierischen Ursprungs enthält. Alle Mahlzeiten werden von Helen Rasmussen, PhD, RD, entworfen und überwacht und in der Küche der Metabolic Research Unit zubereitet. Verpackte gefrorene Mahlzeiten werden den Probanden zum Verzehr zu Hause oder am Arbeitsplatz zur Verfügung gestellt. Kaffee, Tee und andere pflanzliche Getränke sind während der Interventionsphasen nicht erlaubt.

Alle Probanden müssen vor der Aufnahme in die Studie ihre Einverständniserklärung abgeben. Personen werden gemäß den folgenden Ausschlusskriterien auf die Eignung für die Studie geprüft: 1) 3 Monate vor der Studie wurden keine Antibiotika oder Arzneimittel eingenommen, von denen bekannt ist, dass sie die fäkale Mikrobiota beeinflussen; 2) aktive Behandlung von ärztlich diagnostizierten Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Magen-Darm-Erkrankungen; 3) regelmäßige Einnahme von Nahrungsergänzungsmitteln; 4) Koloskopie 2 Monate vor ihrer Einschreibung oder geplant während der Studie; 5) Werte der Standard-Blutbiochemie sind nach Ermessen des Studienarztes kritisch anormal; und 6) Konsum von ≥ 14 Portionen Alkohol pro Woche. Probanden, die alle anderen Eignungskriterien erfüllen und Werte der Blutbiochemie innerhalb normaler Bereiche aufweisen, werden gebeten, an der Studie teilzunehmen.

Während der Studie müssen geeignete Probanden an 1 Screening-Besuch und 9 Studienbesuchen über 5-7 Wochen teilnehmen. Am Ende der Besuche 2 und 6 erhalten die Probanden die zufällig zugewiesenen Tiefkühlmahlzeiten und beginnen mit dem Verzehr der Studienmahlzeiten für 5 Tage. Die Probanden können die Studienmahlzeiten ≥5 Tage konsumieren, bis die Stuhlprobe nach der Intervention entnommen wird. Die gesamte Stuhlprobe wird in einen versiegelten Beutel und dann in eine Kühlbox mit Eisbeuteln gegeben und innerhalb von 24 h zum MRU transportiert. Vor und nach jeder Interventionsphase werden Morgenurin und 30 ml nüchternes Blut sowie alle anderen klinischen Daten erhoben. Alle gesammelten Proben werden bis zur Verwendung bei -80 Grad C gelagert.

Die Stichprobengröße der Studie am Menschen wurde basierend auf der Wirkung von FWCP auf die durch eine pflanzennahrungsfreie Ernährung induzierte Zunahme von gallentoleranten Bakterien und auf der Zunahme von Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta und Blautia coccoides-Eubacterium rectale geschätzt. Da es in der Literatur keine Daten gibt, die die Wirkung von FWCP auf galletolerante Bakterien für die Leistungsberechnung veranschaulichen, werden die Forscher in dem vorgeschlagenen kontrollierten Crossover-Fütterungsversuch 10 Probanden einsetzen, um unsere Hypothese zu testen.

Fäkale DNA wird durch enzymatischen Verdau und Bead-Beating-Schritte extrahiert, gefolgt von der Verwendung des QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen). 16S-rRNA-Gen-Amplikons werden aus der extrahierten DNA unter Verwendung von PCR mit einem Strichcode-Primer-Set generiert, das auf die variable V4-Region ausgerichtet ist. Amplikons werden auf einem Illumina ® MiSeq Sequencer in der Tufts University Core Facility sequenziert, die von Dr. Anne Kane geleitet wird. Die Mikrobiota-Analyse wird mit Qiime v 1.7 durchgeführt. Operative taxonomische Einheiten werden mit UClust generiert. Alpha- und Beta-Diversity-Parameter werden mit Qiime berechnet. Flavonoide und Phenolsäuren im Urin werden mit unserem routinemäßigen HPLC-elektrochemischen Nachweisverfahren bestimmt. Anthocyane und ihre Glucuronidat-Metaboliten im Urin werden routinemäßig mit einem LC-MS/MS-Assay quantifiziert, den die Forscher routinemäßig verwenden. Die kurzkettigen Fettsäuren im Stuhl werden mit einer in unserem Labor etablierten GC-MS-Methode bestimmt. Der pH-Wert im Kotwasser des Kots wird nach der Zentrifugation mit einem pH-Meter bestimmt. Einzelne Gallensäuren im Kot werden mit einem LC-QTOF-MS-Verfahren bestimmt. TMA im Kot wird mit einem spektrophotometrischen Assay bestimmt.