Diversidade e composição da microbiota e biodisponibilidade de polifenóis

Os investigadores propõem a realização de um estudo randomizado, controlado e cruzado em 10 adultos que têm uma evacuação regular (≥5 vezes/semana) e estão dispostos a consumir uma dieta livre de alimentos vegetais. O estudo incluirá duas fases de intervenção de 5 dias com um período de washout de 2 semanas entre os cruzamentos. Todas as refeições serão fornecidas aos sujeitos durante as fases de intervenção. Os indivíduos serão designados aleatoriamente para receber dieta Con ou FWCP contendo 30 gramas de placebo ou FWCP. A dose é selecionada para fornecer quantidades suficientes de flavonoides e PAC que podem ser comparáveis ​​à ingestão média de flavonoides e PAC de 157 mg e 95 mg/d, respectivamente nos EUA. A dieta livre de alimentos vegetais será formulada para conter apenas ingredientes de origem animal. Todas as refeições serão planejadas e supervisionadas por Helen Rasmussen, PhD, RD, e serão preparadas na cozinha da Metabolic Research Unit. Refeições congeladas embaladas serão fornecidas aos sujeitos para consumo em casa ou no trabalho. Café, chá e outras bebidas à base de plantas não serão permitidos durante as fases de intervenção.

Todos os indivíduos serão obrigados a fornecer seu consentimento informado antes de se inscrever no estudo. Os indivíduos serão selecionados para elegibilidade do estudo de acordo com os critérios de exclusão, como segue: 1) nenhum antibiótico ou medicamento conhecido por influenciar a microbiota fecal foi tomado 3 meses antes do estudo; 2) tratamento ativo para doenças diagnosticadas por médicos, como câncer, doenças cardiovasculares, doenças gastrointestinais; 3) uso regular de quaisquer suplementos dietéticos; 4) colonoscopia 2 meses antes de sua inscrição ou agendada durante o estudo; 5) os valores da bioquímica sanguínea padrão são criticamente anormais com base no critério do médico do estudo; e 6) uso de ≥14 porções/semana de álcool. Os indivíduos que atenderem a todos os outros critérios de elegibilidade e tiverem valores de bioquímica sanguínea dentro dos limites normais serão convidados a participar do estudo.

Durante o estudo, os indivíduos elegíveis deverão comparecer a 1 visita de triagem e 9 visitas de estudo durante 5-7 semanas. No final das visitas 2 e 6, os indivíduos receberão as refeições congeladas aleatoriamente designadas e começarão a consumir as refeições do estudo por 5 dias. Os indivíduos podem consumir as refeições do estudo ≥5 da até que a amostra de fezes pós-intervenção seja coletada. Toda a amostra de fezes será colocada em um saco lacrado e, em seguida, em um refrigerador com compressas de gelo e transportada para o MRU em 24 h. A urina local da manhã e 30 mL de sangue em jejum, bem como todos os outros dados clínicos serão coletados antes e depois de cada fase de intervenção. Todas as amostras coletadas serão armazenadas a -80 graus C até o uso.

O tamanho da amostra do ensaio humano foi estimado com base no efeito do FWCP no aumento induzido pela dieta livre de alimentos vegetais em bactérias tolerantes à bile e no aumento de Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta e Blautia coccoides-Eubacterium rectale. Uma vez que não há dados na literatura que ilustrem o efeito do FWCP em bactérias tolerantes à bile para cálculo de poder, os investigadores empregarão no estudo proposto de alimentação cruzada controlada 10 indivíduos para testar nossa hipótese.

O DNA fecal será extraído por digestão enzimática e etapas de batimento de esferas seguidas pelo uso do QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen). Os amplicons do gene 16S rRNA serão gerados a partir do DNA extraído usando PCR com um conjunto de primers com código de barras direcionado para a região variável V4. Os amplicons serão sequenciados em um Illumina ® MiSeq Sequencer na Tufts University Core Facility, dirigida pela Dra. Anne Kane. A análise da microbiota será realizada usando Qiime v 1.7. Unidades taxonômicas operacionais serão geradas usando o UClust. Parâmetros de diversidade alfa e beta serão calculados usando Qiime. Os flavonóides urinários e os ácidos fenólicos serão determinados por nosso método de detecção eletroquímica de rotina por HPLC. As antocianinas e seus metabólitos de glucuronidato na urina serão quantificados por um ensaio de LC-MS/MS usado rotineiramente pelos investigadores. Os ácidos graxos fecais de cadeia curta serão determinados usando um método de GC-MS que foi estabelecido em nosso laboratório. O valor do pH na água fecal das fezes será determinado usando um medidor de pH após a centrifugação. Os ácidos biliares individuais nas fezes serão determinados pelo método LC-QTOF-MS. O TMA nas fezes será determinado por ensaio espectrofotométrico.