Diversidad y composición de la microbiota y biodisponibilidad de polifenoles

Los investigadores proponen realizar un ensayo cruzado, aleatorizado y controlado de alimentación en 10 adultos que tienen una evacuación intestinal regular (≥5 veces por semana) y están dispuestos a consumir una dieta libre de alimentos vegetales. El ensayo incluirá dos fases de intervención de 5 días con un período de lavado de 2 semanas entre los cruces. Todas las comidas se proporcionarán a los sujetos durante las fases de intervención. Los sujetos serán asignados aleatoriamente para recibir una dieta Con o FWCP que contenga 30 gramos de placebo o FWCP. La dosis se selecciona para proporcionar cantidades suficientes de flavonoides y PAC que puedan ser comparables con la ingesta promedio de flavonoides y PAC de 157 mg y 95 mg/d, respectivamente, en EE. UU. La dieta libre de alimentos vegetales se formulará para contener solo ingredientes de origen animal. Todas las comidas serán diseñadas y supervisadas por Helen Rasmussen, PhD, RD, y se prepararán en la cocina de la Unidad de Investigación Metabólica. Se proporcionarán comidas congeladas envasadas a los sujetos para que las consuman en casa o en el trabajo. No se permitirá el café, el té y otras bebidas de origen vegetal durante las fases de intervención.

Todos los sujetos deberán dar su consentimiento informado antes de inscribirse en el estudio. Se evaluará a las personas para determinar su elegibilidad para el estudio de acuerdo con los criterios de exclusión, de la siguiente manera: 1) no se tomaron medicamentos antibióticos o medicamentos que se sabe que influyen en la microbiota fecal 3 meses antes del estudio; 2) tratamiento activo para enfermedades diagnosticadas por médicos, como cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales; 3) uso regular de suplementos dietéticos; 4) colonoscopia 2 meses antes de su inscripción o programada durante el estudio; 5) los valores de bioquímica sanguínea estándar son críticamente anormales según el criterio del médico del estudio; y 6) consumo de ≥14 raciones de alcohol por semana. A los sujetos que cumplan con todos los demás criterios de elegibilidad y tengan valores de bioquímica sanguínea dentro de los rangos normales se les pedirá que participen en el estudio.

Durante el ensayo, los sujetos elegibles deberán asistir a 1 visita de selección y 9 visitas de estudio durante 5 a 7 semanas. Al final de las Visitas 2 y 6, los sujetos recibirán las comidas congeladas asignadas al azar y comenzarán a consumir las comidas del estudio durante 5 días. Los sujetos pueden consumir las comidas del estudio ≥5 días hasta que se recolecte la muestra de heces posterior a la intervención. Toda la muestra de heces se colocará en una bolsa sellada y luego en una hielera con bolsas de hielo y se transportará a la MRU dentro de las 24 h. La orina de la mañana y 30 ml de sangre en ayunas, así como todos los demás datos clínicos, se recopilarán antes y después de cada fase de intervención. Todas las muestras recolectadas se almacenarán a -80 grados C hasta su uso.

El tamaño de la muestra del ensayo en humanos se estimó en función del efecto de FWCP en el aumento de bacterias tolerantes a la bilis inducido por la dieta libre de alimentos vegetales y en el aumento de Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta y Blautia coccoides-Eubacterium rectale. Dado que no hay datos en la literatura que ilustren el efecto de FWCP en las bacterias tolerantes a la bilis para el cálculo del poder, los investigadores emplearán en el ensayo cruzado de alimentación controlada propuesto 10 sujetos para probar nuestra hipótesis.

El ADN fecal se extraerá mediante digestión enzimática y pasos de batido de perlas, seguidos del uso del kit QIAamp Stool DNA Mini (Qiagen). Los amplicones del gen 16S rRNA se generarán a partir del ADN extraído mediante PCR con un conjunto de cebadores con código de barras dirigido a la región variable V4. Los amplicones se secuenciarán en un secuenciador Illumina ® MiSeq en las instalaciones principales de la Universidad de Tufts, que está dirigido por la Dra. Anne Kane. El análisis de microbiota se realizará utilizando Qiime v 1.7. Las unidades taxonómicas operativas se generarán utilizando UClús. Los parámetros de diversidad alfa y beta se calcularán utilizando Qiime. Los flavonoides urinarios y los ácidos fenólicos se determinarán mediante nuestro método de detección electroquímico de HPLC de rutina. Las antocianinas y sus metabolitos de glucuronidato en la orina se cuantificarán mediante un ensayo de LC-MS/MS que los investigadores utilizan de forma rutinaria. Los ácidos grasos de cadena corta fecales se determinarán utilizando un método GC-MS que se ha establecido en nuestro laboratorio. El valor de pH en el agua fecal de las heces se determinará utilizando un medidor de pH después de la centrifugación. Los ácidos biliares individuales en las heces se determinarán mediante un método LC-QTOF-MS. La TMA en las heces se determinará mediante un ensayo espectrofotométrico.