Różnorodność i skład mikrobiomu oraz biodostępność polifenoli

Badacze proponują przeprowadzenie randomizowanego, kontrolowanego, krzyżowego badania żywieniowego na 10 osobach dorosłych, które regularnie wypróżniają się (≥5 razy w tygodniu) i są chętne do spożywania diety wolnej od pokarmów roślinnych. Badanie będzie obejmowało dwie 5-dniowe fazy interwencji z 2-tygodniowym okresem wymywania między przejściami. Wszystkie posiłki będą zapewnione pacjentom podczas faz interwencji. Osobnicy zostaną losowo przydzieleni do otrzymywania diety Con lub FWCP zawierającej 30 gramów dopasowanego placebo lub FWCP. Dawka jest dobrana tak, aby zapewnić wystarczające ilości flawonoidów i PAC, które mogą być porównywalne ze średnim spożyciem flawonoidów i PAC wynoszącym odpowiednio 157 mg i 95 mg/d w USA. Dieta bez pokarmów roślinnych zostanie opracowana tak, aby zawierała wyłącznie składniki pochodzenia zwierzęcego. Wszystkie posiłki będą projektowane i nadzorowane przez dr Helen Rasmussen, RD, i będą przygotowywane w kuchni Jednostki Badań Metabolicznych. Pakowane mrożone posiłki będą dostarczane podmiotom do spożycia w domu lub w pracy. Kawa, herbata i inne napoje roślinne nie będą dozwolone podczas faz interwencji.

Wszyscy uczestnicy będą musieli wyrazić świadomą zgodę przed włączeniem do badania. Osoby zostaną poddane badaniu przesiewowemu pod kątem zakwalifikowania do udziału w badaniu zgodnie z kryteriami wykluczenia, zgodnie z następującymi zasadami: 1) na 3 miesiące przed badaniem nie przyjmowano żadnych antybiotyków ani leków wpływających na mikroflorę kałową; 2) czynne leczenie chorób zdiagnozowanych przez lekarza, takich jak nowotwory, choroby układu krążenia, choroby przewodu pokarmowego; 3) regularne stosowanie jakichkolwiek suplementów diety; 4) kolonoskopia 2 miesiące przed ich włączeniem lub planowana w trakcie badania; 5) wartości standardowych biochemii krwi są krytycznie nieprawidłowe na podstawie uznania lekarza prowadzącego badanie; oraz 6) spożywanie ≥14/tyg. porcji alkoholu. Pacjenci, którzy spełniają wszystkie inne kryteria kwalifikacyjne i mają wartości biochemii krwi w normalnych zakresach, zostaną poproszeni o udział w badaniu.

Podczas badania kwalifikujący się uczestnicy będą musieli wziąć udział w 1 wizycie przesiewowej i 9 wizytach studyjnych w ciągu 5-7 tygodni. Pod koniec wizyt 2 i 6 badani otrzymają losowo przydzielone mrożone posiłki i zaczną spożywać badane posiłki przez 5 dni. Pacjenci mogą spożywać badane posiłki ≥5 dni do czasu pobrania próbki kału po interwencji. Cała próbka kału zostanie umieszczona w zapieczętowanej torbie, a następnie w lodówce z okładami z lodu i przetransportowana do MRU w ciągu 24 godzin. Poranny mocz i 30 ml krwi na czczo, a także wszystkie inne dane kliniczne zostaną zebrane przed i po każdej fazie interwencji. Wszystkie pobrane próbki będą przechowywane w temperaturze -80 stopni C do czasu użycia.

Wielkość próby w badaniu na ludziach oszacowano na podstawie wpływu FWCP na indukowany dietą roślinną wzrost liczby bakterii tolerujących żółć oraz wzrost liczby Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta i Blautia coccoides-Eubacterium rectale. Ponieważ w literaturze nie ma danych ilustrujących wpływ FWCP na bakterie tolerujące żółć w celu obliczenia mocy, badacze wykorzystają w proponowanej krzyżowej kontrolowanej próbie karmienia 10 osób, aby przetestować naszą hipotezę.

DNA kałowe zostanie wyekstrahowane przez trawienie enzymatyczne i etapy ubijania kulek, a następnie przy użyciu zestawu QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen). Amplikony genu 16S rRNA zostaną wygenerowane z wyekstrahowanego DNA za pomocą PCR z zestawem starterów z kodem kreskowym ukierunkowanym na region zmienny V4. Amplikony będą sekwencjonowane na sekwenatorze Illumina® MiSeq w Tufts University Core Facility, kierowanym przez dr Anne Kane. Analiza mikroflory zostanie przeprowadzona przy użyciu Qiime v 1.7. Operacyjne jednostki taksonomiczne będą generowane przy użyciu UClust. Parametry różnorodności alfa i beta zostaną obliczone przy użyciu Qiime. Flawonoidy i kwasy fenolowe w moczu zostaną oznaczone za pomocą naszej rutynowej metody wykrywania elektrochemicznego HPLC. Antocyjany i ich glukuronidowe metabolity w moczu będą oznaczane ilościowo za pomocą testu LC-MS/MS, którego badacze rutynowo używają. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w kale będą oznaczane metodą GC-MS, która została ustalona w naszym laboratorium. Wartość pH w wodzie kałowej w kale zostanie określona za pomocą pehametru po odwirowaniu. Poszczególne kwasy żółciowe w kale zostaną oznaczone metodą LC-QTOF-MS. TMA w kale zostanie określony za pomocą testu spektrofotometrycznego.