A mikrobióta sokfélesége és összetétele, valamint a polifenolok biológiai hozzáférhetősége

A kutatók azt javasolják, hogy végezzenek egy randomizált, ellenőrzött táplálkozási, keresztezett etetési kísérletet 10 olyan felnőtt részvételével, akiknek rendszeres székletürítésük van (≥5 alkalom/hét), és hajlandóak növényi élelmiszerektől mentes étrendet fogyasztani. A próba két 5 napos beavatkozási fázist fog tartalmazni, 2 hetes kimosási periódussal a keresztezések között. A beavatkozási szakaszokban az alanyok minden étkezést biztosítanak. Az alanyokat véletlenszerűen besorolják, hogy Con vagy FWCP diétát kapjanak, amely 30 gramm megfelelő placebót vagy FWCP-t tartalmaz. Az adagot úgy választják meg, hogy elegendő mennyiségű flavonoidot és PAC-t biztosítson, amely összemérhető az átlagos flavonoid- és PAC-bevitellel, 157 mg/nap, illetve 95 mg/nap az Egyesült Államokban. A növényi táplálékmentes étrendet úgy alakítják ki, hogy kizárólag állati eredetű összetevőket tartalmazzon. Az összes ételt Helen Rasmussen, PhD, RD tervezi és felügyeli, és a Metabolic Research Unit konyhájában készítik el. Csomagolt fagyasztott ételeket biztosítanak az alanyoknak, amelyeket otthon vagy munkahelyen fogyaszthatnak el. Kávé, tea és egyéb növényi alapú italok fogyasztása tilos a beavatkozási szakaszokban.

Minden alanynak meg kell adnia tájékozott beleegyezését a vizsgálatba való beiratkozás előtt. Az egyének vizsgálatra való alkalmasságát a kizárási kritériumok szerint szűrik, az alábbiak szerint: 1) a vizsgálat előtt 3 hónappal nem szedtek antibiotikumot vagy olyan gyógyszert, amelyről ismert volt, hogy befolyásolják a széklet mikrobiotáját; 2) orvos által diagnosztizált betegségek, például rák, szív- és érrendszeri betegségek, gyomor-bélrendszeri betegségek aktív kezelése; 3) bármely étrend-kiegészítő rendszeres használata; 4) kolonoszkópia 2 hónappal a felvételük előtt vagy a vizsgálat ideje alatt; 5) a standard vérbiokémiai értékek kritikusan abnormálisak a vizsgálóorvos mérlegelése alapján; és 6) ≥14/hét adag alkohol fogyasztása. Azokat az alanyokat, akik megfelelnek az összes többi alkalmassági feltételnek, és a vér biokémiai értékei a normál tartományon belül vannak, felkérjük, hogy vegyenek részt a vizsgálatban.

A vizsgálat során a jogosult alanyoknak 1 szűrővizsgálaton és 9 tanulmányi látogatáson kell részt venniük 5-7 héten keresztül. A 2. és 6. látogatás végén az alanyok megkapják a véletlenszerűen kiosztott fagyasztott ételeket, és 5 napon keresztül elkezdik fogyasztani a vizsgálati ételeket. Az alanyok a vizsgálati ételeket ≥5 napon át fogyaszthatják, amíg a beavatkozás utáni székletmintát le nem veszik. A teljes székletmintát egy lezárt zacskóba, majd jégakkukkal ellátott hűtőbe kell helyezni, és 24 órán belül az MRU-ba szállítják. Minden beavatkozási fázis előtt és után összegyűjtik a reggeli vizeletet és 30 ml éhgyomri vért, valamint minden egyéb klinikai adatot. Minden összegyűjtött mintát -80 C-on tárolunk a felhasználásig.

A humán vizsgálat mintanagyságát az FWCP hatása alapján becsülték meg a növényi táplálékmentes étrend által kiváltott epetoleráns baktériumok növekedésére, valamint az Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta és Blautia coccoides-Eubacterium rectale növekedésére. Mivel az irodalomban nincs adat az FWCP epetoleráns baktériumokra gyakorolt ​​hatásáról a teljesítményszámításhoz, a vizsgálók a javasolt keresztezett, kontrollált táplálási kísérletben 10 alanyt alkalmaznak hipotézisünk tesztelésére.

A széklet DNS-ét enzimatikus emésztéssel és gyöngyverő lépésekkel vonják ki, majd a QIAamp széklet DNS Mini Kit (Qiagen) használatával. Az extrahált DNS-ből 16S rRNS génamplikonokat állítunk elő PCR-rel, vonalkódolt primerkészlettel, amely a V4 variábilis régiót célozza meg. Az amplikonokat Illumina ® MiSeq Sequencer segítségével szekvenálják a Tufts University Core Facility-ben, amelyet Dr. Anne Kane irányít. A mikrobiota elemzést a Qiime v 1.7 használatával hajtják végre. Az operatív taxonómiai egységeket az UClust segítségével állítják elő. Az alfa- és béta-diverzitási paraméterek kiszámítása a Qiime segítségével történik. A vizelet flavonoidok és fenolsavak meghatározása rutin HPLC-elektrokémiai kimutatási módszerünkkel történik. Az antocianinokat és glükuronidát metabolitjaikat a vizeletben egy LC-MS/MS vizsgálattal határozzák meg, amelyet a vizsgálók rutinszerűen használnak. A széklet rövid szénláncú zsírsavait a laboratóriumunkban kialakított GC-MS módszerrel határozzuk meg. A széklet ürülékvíz pH-értékét centrifugálás után pH-mérővel határozzuk meg. A széklet egyes epesavait LC-QTOF-MS módszerrel határozzuk meg. A székletben lévő TMA meghatározása spektrofotometriás vizsgálattal történik.