Diversità e composizione del microbiota e biodisponibilità dei polifenoli

I ricercatori propongono di condurre uno studio randomizzato, controllato e incrociato su 10 adulti che hanno un movimento intestinale regolare (≥5 volte/settimana) e sono disposti a consumare una dieta priva di cibi vegetali. Lo studio includerà due fasi di intervento di 5 giorni con un periodo di washout di 2 settimane tra i crossover. Tutti i pasti saranno forniti ai soggetti durante le fasi di intervento. I soggetti verranno assegnati in modo casuale a ricevere una dieta Con o FWCP contenente 30 grammi di placebo o FWCP abbinati. La dose è selezionata in modo da fornire quantità sufficienti di flavonoidi e PAC che possono essere paragonabili all'assunzione media di flavonoidi e PAC rispettivamente a 157 mg e 95 mg/die negli Stati Uniti. La dieta priva di alimenti vegetali sarà formulata per contenere solo ingredienti di origine animale. Tutti i pasti saranno progettati e supervisionati da Helen Rasmussen, PhD, RD, e saranno preparati nella cucina dell'Unità di ricerca metabolica. Ai soggetti verranno forniti pasti surgelati confezionati da consumare a casa o al lavoro. Durante le fasi di intervento non saranno ammessi caffè, tè e altre bevande di origine vegetale.

A tutti i soggetti sarà richiesto di fornire il proprio consenso informato prima dell'arruolamento nello studio. Gli individui saranno sottoposti a screening per l'ammissibilità allo studio in base ai criteri di esclusione, come segue: 1) nessun farmaco antibiotico o farmaco noto per influenzare il microbiota fecale è stato assunto 3 mesi prima dello studio; 2) trattamento attivo per malattie diagnosticate dal medico, come cancro, malattie cardiovascolari, malattie gastrointestinali; 3) uso regolare di eventuali integratori alimentari; 4) colonscopia 2 mesi prima dell'arruolamento o programmata durante lo studio; 5) i valori delle biochimiche del sangue standard sono criticamente anormali in base alla discrezione del medico dello studio; e 6) consumo di ≥14 porzioni/settimana di alcol. I soggetti che soddisfano tutti gli altri criteri di ammissibilità e hanno valori di biochimica del sangue entro intervalli normali verrà chiesto di partecipare allo studio.

Durante lo studio, i soggetti idonei dovranno partecipare a 1 visita di screening e 9 visite di studio nell'arco di 5-7 settimane. Alla fine delle visite 2 e 6, i soggetti riceveranno i pasti surgelati assegnati in modo casuale e inizieranno a consumare i pasti dello studio per 5 giorni. I soggetti possono consumare i pasti dello studio ≥5 giorni fino a quando non viene raccolto il campione di feci post-intervento. L'intero campione di feci verrà posto in un sacchetto sigillato e poi in un dispositivo di raffreddamento con impacchi di ghiaccio e trasportato all'MRU entro 24 ore. L'urina mattutina e 30 ml di sangue a digiuno così come tutti gli altri dati clinici saranno raccolti prima e dopo ogni fase di intervento. Tutti i campioni raccolti saranno conservati a -80°C fino all'utilizzo.

La dimensione del campione della sperimentazione umana è stata stimata sulla base dell'effetto del FWCP sull'aumento indotto dalla dieta priva di alimenti vegetali di batteri tolleranti alla bile e sull'aumento di Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta e Blautia coccoides-Eubacterium rectale. Poiché non ci sono dati in letteratura che illustrino l'effetto di FWCP sui batteri tolleranti alla bile per il calcolo della potenza, i ricercatori impiegheranno nella prova di alimentazione controllata crossover proposta 10 soggetti per testare la nostra ipotesi.

Il DNA fecale sarà estratto mediante digestione enzimatica e fasi di perlinatura seguite dall'uso del QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen). Gli ampliconi del gene 16S rRNA saranno generati dal DNA estratto mediante PCR con un set di primer con codice a barre mirato alla regione variabile V4. Gli ampliconi saranno sequenziati su un sequenziatore MiSeq Illumina ® presso la Tufts University Core Facility, diretta dalla Dott.ssa Anne Kane. L'analisi del microbiota verrà eseguita utilizzando Qiime v 1.7. Le unità tassonomiche operative saranno generate utilizzando UClust. I parametri di diversità alfa e beta saranno calcolati utilizzando Qiime. I flavonoidi e gli acidi fenolici urinari saranno determinati mediante il nostro metodo di rilevamento elettrochimico HPLC di routine. Gli antociani ei loro metaboliti glucuronidati nelle urine saranno quantificati mediante un test LC-MS/MS utilizzato abitualmente dai ricercatori. Gli acidi grassi fecali a catena corta saranno determinati utilizzando un metodo GC-MS che è stato stabilito nel nostro laboratorio. Il valore del pH nell'acqua fecale delle feci sarà determinato utilizzando un pHmetro dopo la centrifugazione. I singoli acidi biliari nelle feci saranno determinati utilizzando un metodo LC-QTOF-MS. Il TMA nelle feci sarà determinato utilizzando un saggio spettrofotometrico.