Разнообразие и состав микробиоты и биодоступность полифенолов

Исследователи предлагают провести рандомизированное контролируемое перекрестное исследование с участием 10 взрослых, которые имеют регулярный стул (≥5 раз в неделю) и готовы соблюдать диету, свободную от растительной пищи. Испытание будет включать две 5-дневные фазы вмешательства с 2-недельным периодом вымывания между кроссоверами. Все блюда будут предоставлены субъектам на этапах вмешательства. Субъекты будут случайным образом распределены для получения диеты Con или FWCP, содержащей 30 граммов соответствующего плацебо или FWCP. Доза выбирается таким образом, чтобы обеспечить достаточное количество флавоноидов и ПАЦ, которое может быть сравнимо со средним потреблением флавоноидов и ПАЦ при 157 мг и 95 мг/сут соответственно в США. Диета без растительной пищи будет составлена ​​так, чтобы содержать только ингредиенты животного происхождения. Все блюда будут разрабатываться и контролироваться Хелен Расмуссен, доктором философии, доктором медицинских наук, и готовиться на кухне отдела метаболических исследований. Субъектам будут предоставлены упакованные замороженные блюда для употребления дома или на работе. Кофе, чай и другие напитки на растительной основе не будут разрешены на этапах вмешательства.

Все субъекты должны будут дать свое информированное согласие до включения в исследование. Индивидуумы будут проходить скрининг на предмет приемлемости для участия в исследовании в соответствии со следующими критериями исключения: 1) за 3 месяца до исследования не принимались антибиотики или препараты, о которых известно, что они влияют на фекальную микробиоту; 2) активное лечение диагностированных врачом заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта; 3) регулярное употребление любых БАДов; 4) колоноскопия за 2 месяца до их включения или запланированная во время исследования; 5) значения стандартных биохимических анализов крови являются критически ненормальными по усмотрению врача-исследователя; и 6) употребление ≥14 порций алкоголя в неделю. Субъектам, которые соответствуют всем другим критериям приемлемости и имеют значения биохимических показателей крови в пределах нормы, будет предложено принять участие в исследовании.

Во время испытания подходящие субъекты должны будут посетить 1 посещение для скрининга и 9 учебных посещений в течение 5-7 недель. В конце визитов 2 и 6 испытуемые получат случайным образом назначенные замороженные блюда и начнут употреблять исследуемые блюда в течение 5 дней. Субъекты могут потреблять исследуемую пищу в течение ≥5 дней до тех пор, пока не будет собрана проба стула после вмешательства. Весь образец стула будет помещен в герметичный пакет, а затем в холодильник с пакетами со льдом и доставлен в MRU в течение 24 часов. Утренняя порция мочи и 30 мл крови натощак, а также все другие клинические данные будут собираться до и после каждой фазы вмешательства. Все собранные образцы будут храниться при температуре -80°C до использования.

Размер выборки в испытании на людях был оценен на основе влияния FWCP на увеличение числа толерантных к желчи бактерий, вызванное диетой без растительной пищи, и на увеличение количества Enterococcus, Bifidobacterium, Eggerthella lenta и Blautia coccoides-Eubacterium rectal. Поскольку в литературе нет данных, иллюстрирующих влияние FWCP на толерантные к желчи бактерии для расчета мощности, исследователи будут использовать в предлагаемом перекрестном контролируемом испытании с кормлением 10 субъектов для проверки нашей гипотезы.

ДНК фекалий будет извлечена путем ферментативного расщепления и измельчения с последующим использованием набора QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen). Ампликоны гена 16S рРНК будут генерироваться из выделенной ДНК с использованием ПЦР с набором праймеров со штрих-кодом, нацеленным на вариабельную область V4. Ампликоны будут секвенированы на секвенаторе Illumina® MiSeq Sequencer в Центральном центре Университета Тафтса, которым руководит доктор Энн Кейн. Анализ микробиоты будет проводиться с использованием Qiime v 1.7. Операционные таксономические единицы будут генерироваться с использованием UClust. Параметры альфа- и бета-разнообразия будут рассчитываться с использованием Qiime. Мочевые флавоноиды и фенольные кислоты будут определяться нашим стандартным методом ВЭЖХ-электрохимического обнаружения. Антоцианы и их метаболиты глюкуронидата в моче будут количественно определяться с помощью анализа ЖХ-МС/МС, который исследователи обычно используют. Жирные кислоты с короткой цепью в кале будут определяться с использованием метода ГХ-МС, разработанного в нашей лаборатории. Значение рН в фекальной воде фекалий будет определяться с помощью рН-метра после центрифугирования. Индивидуальные желчные кислоты в кале будут определяться методом LC-QTOF-MS. ТМА в фекалиях будет определяться с помощью спектрофотометрического анализа.