Mikrobiootan monimuotoisuus ja koostumus sekä polyfenolin biologinen hyötyosuus

Tutkijat ehdottavat satunnaistetun, kontrolloidun ruokinnan ja risteytyksen suorittamista 10 aikuisella, joilla on säännöllinen ulostaminen (≥ 5 kertaa/vko) ja jotka ovat valmiita nauttimaan kasvisruokia sisältämättömästä ruokavaliosta. Kokeilu sisältää kaksi 5-päiväistä interventiovaihetta, joissa on 2 viikon huuhtelujakso jakojaksojen välillä. Kaikki ateriat tarjotaan koehenkilöille interventiovaiheiden aikana. Koehenkilöt jaetaan satunnaisesti saamaan joko Con- tai FWCP-ruokavaliota, joka sisältää 30 grammaa vastaavaa lumelääkettä tai FWCP:tä. Annos valitaan, jotta saadaan riittävä määrä flavonoidia ja PAC:ta, jotka voivat olla verrattavissa keskimääräiseen flavonoidin ja PAC:n saantiin 157 mg:lla ja 95 mg/d, vastaavasti Yhdysvalloissa. Kasviruokavapaa ruokavalio laaditaan siten, että se sisältää vain eläinperäisiä ainesosia. Kaikki ateriat suunnittelee ja valvoo PhD, RD Helen Rasmussen, ja ne valmistetaan aineenvaihdunnan tutkimusyksikön keittiössä. Pakattu pakasteaterioita tarjotaan koehenkilöille kotona tai töissä nautittavaksi. Kahvi, tee ja muut kasvipohjaiset juomat eivät ole sallittuja interventiovaiheiden aikana.

Kaikkien koehenkilöiden on annettava tietoinen suostumuksensa ennen tutkimukseen ilmoittautumista. Yksilöt seulotaan tutkimukseen kelpaavuuden suhteen poissulkemiskriteerien mukaisesti seuraavasti: 1) antibioottilääkkeitä tai lääkkeitä, joiden tiedetään vaikuttavan ulosteen mikrobiotaan, ei ole otettu 3 kuukautta ennen tutkimusta; 2) lääkärin diagnosoimien sairauksien, kuten syövän, sydän- ja verisuonitautien, maha-suolikanavan sairauksien aktiivinen hoito; 3) minkä tahansa ravintolisän säännöllinen käyttö; 4) kolonoskopia 2 kuukautta ennen ilmoittautumista tai tutkimuksen aikana; 5) standardiveren biokemian arvot ovat kriittisesti poikkeavia tutkimuslääkärin harkinnan perusteella; ja 6) ≥14/vko alkoholiannoksen käyttö. Koehenkilöt, jotka täyttävät kaikki muut kelpoisuusvaatimukset ja joiden veren biokemian arvot ovat normaaleissa rajoissa, pyydetään osallistumaan tutkimukseen.

Kokeen aikana kelvollisten koehenkilöiden tulee osallistua 1 seulontakäynnille ja 9 opintokäynnille 5–7 viikon aikana. Vierailujen 2 ja 6 lopussa koehenkilöt saavat satunnaisesti määrätyt pakasteateriat ja alkavat syödä tutkimusaterioita 5 päivän ajan. Koehenkilöt voivat syödä tutkimusaterioita ≥ 5 päivää, kunnes intervention jälkeinen ulostenäyte on kerätty. Koko ulostenäyte laitetaan suljettuun pussiin ja sitten jäähdyttimeen jääpakkausten kanssa ja kuljetetaan MRU:lle 24 tunnin kuluessa. Aamupistevirtsa ja 30 ml paastoverta sekä kaikki muut kliiniset tiedot kerätään ennen jokaista interventiovaihetta ja sen jälkeen. Kaikki kerätyt näytteet säilytetään -80 asteessa käyttöön asti.

Ihmiskokeen otoskoko arvioitiin perustuen FWCP:n vaikutukseen kasvisruokavapaan ruokavalion aiheuttamaan sappitoleranssien lisääntymiseen sekä Enterococcus-, Bifidobacterium-, Eggerthella lenta- ja Blautia coccoides-Eubacterium rectale -bakteerien lisääntymiseen. Koska kirjallisuudessa ei ole tietoa, joka havainnollistaisi FWCP:n vaikutusta sappitoleranssiin bakteereihin teholaskennassa, tutkijat käyttävät ehdotetussa crossover-kontrolloidussa ruokintakokeessa 10 henkilöä hypoteesimme testaamiseen.

Ulosteen DNA uutetaan entsymaattisella pilkkomalla ja pilkkomalla, mitä seuraa QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen) käyttö. 16S-rRNA-geeniamplikonit muodostetaan uutetusta DNA:sta käyttämällä PCR:ää viivakoodatun alukkeen kanssa, joka on kohdistettu V4-variaabelialueelle. Amplikonit sekvensoidaan Illumina ® MiSeq Sequencer -laitteessa Tufts University Core Facilityssä, jota ohjaa tohtori Anne Kane. Mikrobiota-analyysi suoritetaan käyttämällä Qiime v 1.7:ää. Operatiiviset taksonomiset yksiköt luodaan UClustin avulla. Alfa- ja beta-diversiteetin parametrit lasketaan Qiimen avulla. Virtsan flavonoidit ja fenolihapot määritetään rutiininomaisella HPLC-sähkökemiallisella tunnistusmenetelmällämme. Antosyaanit ja niiden glukuronidaattimetaboliitit virtsassa määritetään LC-MS/MS-määrityksellä, jota tutkijat käyttävät rutiininomaisesti. Ulosteen lyhytketjuiset rasvahapot määritetään laboratoriossamme vakiintuneella GC-MS-menetelmällä. Ulosteen ulosteveden pH-arvo määritetään pH-mittarilla sentrifugoinnin jälkeen. Ulosteiden yksittäiset sappihapot määritetään LC-QTOF-MS-menetelmällä. Ulosteessa oleva TMA määritetään käyttämällä spektrofotometristä määritystä.