Odhad hladin MMP-8 v GCF a séru a jeho korelace s hojením ran a klinickými výsledky po štěpu koronálně pokročilého laloku a subepiteliálního pojivového tkáňového štěpu pro pokrytí kořenů u recesních defektů: KLINICKO-BIOCHEMICKÁ STUDIE

POTŘEBA KE STUDIU:

Koronálně pokročilý lalok s technikou subepiteliálního pojivového tkáňového štěpu (CAF+SCTG) se ukázal jako jeden z nejúspěšnějších způsobů pokrytí kořenů.1 Úspěch každého chirurgického zákroku závisí na hojení rány.

Hojení ran po chirurgickém zákroku je složitá a vysoce organizovaná událost, která zahrnuje hemostatickou fázi, zánětlivou fázi, fázi tvorby nové tkáně a konečnou fázi remodelace, která zanechává extracelulární matrix bohatou na kolagen (ECM) a hustou a stabilní tkáň.2 Během hojení ran poskytuje sraženina základ pro budoucí ECM. ECM hraje zásadní roli při urychlení buněčné migrace, adheze, kontrakcí rány a epitelizace. Tato klíčová role ECM je udržována skupinou enzymů souhrnně známých jako matricové metaloproteinázy (MMP). MMP hrají ústřední roli při hojení ran.3,4 Selhání regulace těchto MMP souvisí se špatným hojením ran.3,4 MMP (tj. kolagenázy, gelatinázy, matrilysiny, stromelysiny a MMP membránového typu) jsou rodinou endopeptidáz závislých na zinku schopných štěpit extracelulární matrix (ECM) při hojení ran.3 MMP-8 jsou primárně produkovány neutrofily a jsou také produkovány jinými buňkami, jako jsou orální epiteliální buňky, plazmatické buňky a fibroblasty.7 MMP-8 je exprimován během myelocytární fáze vývoje prekurzorů PMN (polymorfonukleárních buněk) v kostní dřeni29 a je uložen jako latentní enzym (pro-mmp-8) ve specifických granulích PMN.30 Pro-MMP-8 se rychle uvolňuje z aktivovaného PMN podstupujícího degranulaci31 a poté je aktivován mechanismem přepínání cysteinu za vzniku aktivní formy enzymu.29 MMP-8 (polymorfonukleární kolagenáza5) štěpí trojitou spirálu fibrilárního kolagenu a má afinitu k typu I kolagen a kolagen typu III5, který se hojně nachází v pojivové tkáni dásní. MMP-8 degraduje želatinu typu VII, VIII a X kolagen.5 Předpokládá se, že MMP-8 je důležitá pro akutní hojení ran.6 Důležité je posouzení progrese hojení ran po operaci. V současné době se používají tupé náhradní markery, jako je sondování. Omezení těchto markerů je v tom, že představují historii léčení a ne probíhající činnost. Protože charakteristickým znakem hojení je remodelace kolagenu, je zajímavé studovat cytokinový profil, který se týká hojení ran. Tyto znalosti mohou potenciálně vést k novým diagnostickým strategiím pro studium hojení ran lépe odrážejícím fenotyp hojení.

Funkce kolagenázy během normálního hojení ran po parodontální chirurgii byla poměrně špatně definována kvůli nedostatku studií v této oblasti.10 Většina výzkumu se soustředila na charakterizaci MMP-8 během patogeneze onemocnění parodontu8 a na změny hladiny MMP-8 po léčbě parodontu.

Nwomeh et al studovali MMP-8 z hojení dermálních ran sběrem exsudátu z rány z okluzivního obvazu. Poznamenal, že MMP-8 dosáhl vrcholu 4. den a přetrvával asi týden. Nadměrná exprese MMP-8 vede k chybnému hojení.5 Chronické rány mají 30krát vyšší MMP než akutní rány. Inhibice nadměrné exprese proteázy v těchto ranách může umožnit prospektivní léčbu hojení ran.5 Velmi méně je známo o buněčných aspektech hojení měkkých tkání v ústní sliznici. Předpoklad, že orální hojení je podobné dermálním ranám, může vyvolat zmatek, protože existují určité jemné rozdíly, jako je snížená tvorba jizev v dermálních ranách2, role IL-1 v orálních ranách a nepřítomnost IL-1 v dermálních ranách11, rychlejší hojení v orální rány, přítomnost slin, které napomáhají hojení atd. Celkově je stále předmětem spekulací a nejasností ohledně rozdílů v jedinečném způsobu hojení ran v dutině ústní.

Pochopení hojení ran na molekulární úrovni poskytuje hluboký základ pro vývoj léčebných strategií, které mohou zabránit opožděnému hojení.2 Jak doporučuje Consensus Report z 10. evropského workshopu o parodontologii, že je potřeba více studií na buněčné úrovni k identifikaci cytokinových, chemokinových a intracelulárních signálních sítí pro lepší regenerační přístupy10, byla navržena tato klinická studie.

Vzhledem ke značným mezerám v této oblasti parodontologického výzkumu je tato studie plánována tak, aby zhodnotila hladiny MMP-8 během pooperačního hojení po operaci CAF+SCTG pro pokrytí recese a lépe identifikovala mechanismus zapojený do hojení ran. Tyto informace mohou být použity k tomu, aby se zabránilo změně hojení normální chirurgické rány.

6.2 PŘEHLED LITERATURY: Sanctis et al. (2011) provedli studii ke stanovení použití pojivového štěpu (CTG) při pokrytí kořenů. Výsledky prokázaly, že CAF ve spojení s SCTG je validním přístupem v léčbě recesních defektů Nwomeh et al. (1999) hodnotili zdroje kolagenáz (MMP-8, MMP-1) a jejich aktivitu u normálně se hojících ran a chronických nehojících se vředů. Výsledky ukázaly, že MMP-8 je převládající kolagenáza přítomná v normálně se hojících ranách a chronické nehojící se vředy měly zvýšenou hladinu MMP-1,8 a snížené hladiny TIMP-1 Armstrong et al (2002) zhodnotili klíčovou roli MMP-8 v hojení ran jako převládající kolagenáza. Zpracoval vyjádření maximálních hladin MMP-8 v den 4 a 7 během normálního hojení ran.

Hammerle et al (2014) v konsensuální zprávě, která přezkoumala biologické procesy hojení ran měkkých tkání v dutině ústní, zjistili, že hojení měkkých tkání v ústech u zubů, implantátů a bezzubého hřebene probíhá ve stejné fázi jako hojení kožních ran a histologické údaje u člověka jsou omezený.

Sorsa et al (2010) ve své studii porovnali čtyři metody pro detekci matrix metaloproteinázy gingivální crevikulární tekutiny (MMP-8), tj. imunofluorometrický test, test Dip stick, dentoAnalyser immunoblot assay a ELISA kit, a dospěli k závěru, že všechny testy jsou srovnatelné a dentoAnalyser je mezi prvními kvantitativními testovacími zařízeními na straně křesla MMP-8 v diagnostice a výzkumu parodontu a periimplantátu.

Fernandez et al (2007) provedli studii zkoumající roli MMP_8 při hojení kožních ran. Pozorovali významné zpoždění v uzavření rány u MMP-8 -/- myší a změněnou zánětlivou reakci v jejich ranách. Uvedli, že MMP-8 se podílí na hojení ran vyřešením zánětu a otevírá možnost vyvinout nové strategie pro léčbu defektů hojení ran.

Mohd H a ​​kol. (1999)19 hodnotili hladiny MMP-8 a MMP-3 během časné fáze hojení po řízeném postupu regenerace tkáně hodnocením vzorků GCF (gingival Crevicular Fluid) pro kvantifikaci MMP-8 a MMP-3. Zjistili, že přítomnost membrány zřejmě zvyšuje hladiny MMP-3 a -8 a souvisí s resorpcí bioresorbovatelné membrány hostitelskými systémy.

Dickinson et al (2013) studovali rané děje v periodontální regeneraci na modelu supraalveolárního parodontálního defektu u psů pomocí histologických a imunologických technik a došli k závěru, že aktivace buněčných regeneračních dějů při regeneraci periodontální rány je rychlá, což je obecný rámec tvorby tkáně ( kosti , periodontální vaz a pojivová tkáň) je široce popsána během 14 dnů.

Shaw et al (2009) provedli stručný přehled hojení ran a popsali složitý proces hojení ran. Zdůraznil, že remodelace extracelulární matrice je dosažena jemnou rovnováhou MMP.

Teles et al (2010) měřili hladiny biomarkerů GCF a subgingiválních bakteriálních druhů u periodontálně zdravých jedinců a pacientů s parodontitidou. Dospěl k závěru, že klinicky zdravá místa od subjektů s parodontitidou vykazují vyšší hladiny biomarkerů GCF a parodontálních patogenů než místa od zdravých subjektů.

6.3 Cíl studie: Primárním cílem této studie je vyhodnotit účinek a dopad CAF+SCTG na pokrytí kořenů v místech gingivální recese Millersovy třídy I a II na hladiny MMP-8 v GCF a séru.

Sekundárním cílem je otestovat užitečnost základní úrovně MMP-8 při predikci kategoricky hodnocených výsledků léčby a korelovat ji s modelem časného hojení ran podle CAF+SCTG pro pokrytí kořenů.

MATERIÁLY A METODY:

7.1 Zdroj dat:

Pacienti navštěvující ambulantní oddělení parodontologie, Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital a splňující kritéria pro zařazení a vyloučení, budou vyšetřeni a vybráni do studie.

Experimentální design se bude skládat z celkem 15-20 míst, která budou přijata do studie podle kritérií pro zařazení a vyloučení. Pacienti budou informováni o chirurgickém postupu a materiálech použitých pro studii a bude od nich získán informovaný souhlas.

7.2 Způsob sběru dat:

Velikost vzorku:

Tato prospektivní studie bude jedinou slepou srovnávací klinickou kontrolní studií s 15–20 pacienty s recesními defekty Millerovy třídy I a II v předním čelistním oblouku.

Technika odběru vzorků

• Po screeningových vyšetřeních v úvodní fázi dostane každý subjekt sezení instrukcí o ústní hygieně, škálování a plánování kořenů pomocí ultrazvukových scalerů a ručních kyret.
• Chirurgická léčba recesního defektu nebude naplánována, dokud pacient neprokáže adekvátní standard kontroly supragingiválního plaku (skóre plaku <20 % O Leary 1972). Níže uvedené klinické parametry budou zaznamenávány s přesností na milimetr pomocí sondy UNC-15 (University of North Carolina -15 periodontal probe -Hu Friedy, Chicago, IL, USA) a měřící okluzní stenty pro polohování měřících sond budou vyrobeny s za studena vytvrzovaná akrylová pryskyřice na litém modelu získaném alginátovým otiskem. Bude konstruován tak, aby pokrýval okluzní povrchy ošetřovaného zubu a okluzní povrchy alespoň jednoho zubu v meziálním a distálním směru. Bude také rozšířena apikálně na bukální a lingvální povrch, aby pokryla koronální třetinu zubů. Na stentu budou vyznačeny tři drážky v meziobukálních, středních bukálních a distobukálních místech jako referenční body15, takže pooperační měření bude provedeno ve stejné poloze a angulaci jako ty provedené před operací, tj. základní měření a poté po 6. měsíce.
• Vzorek GCF bude odebrán z gingiválního sulku zubu indikovaného ke krytí kořene (negativní kontrola) a z jiného zubu s klinicky zdravou gingivou (pozitivní kontrola). Vzorky budou odebrány na začátku a při následném pooperačním sledování (čtvrtý den, sedmý den a 6 měsíců).

Klinická měření:

Následující klinické měření bude zaznamenáno na začátku a po 6 měsících.

1. Hloubka gingivální recese (GRD), měřená jako vzdálenost mezi CEJ a okrajem gingivy.17
2. Gingival Recession Width (GRW), měřená jako vzdálenost mezi meziálním gingiválním okrajem a distálním gingiválním okrajem.17
3. Hloubka sondy (PD), měřená jako vzdálenost od gingiválního okraje k bázi gingiválního sulcus.17
4. Clinical Attachment Level (CAL), měření od CEJ (Cementoenamel junction) k bázi gingiválního sulcus.17
5. Apico koronální šířka keratinizované tkáně (KTW) měřená jako vzdálenost od mukogingiválního spojení k gingiválnímu okraji.17
6. Indexy hojení ran (WHI) budou hodnoceny 4. a 7. den (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Plaque Index (Sillness and Loe, 1964)
8. Gingival Index (Loe and Sillness, 1963)
9. Index krvácení dásní (Ainamo a Bay, 1975)

CHIRURGICKÝ ZÁSAH:

• Před zahájením operace budou povrchy kořenů blízko ztráty bukálního úponu instrumentovány pomocí mini-pěti Gracey Currettes a mechanické ošetření bude ukončeno, když budou získány hladké a tvrdé povrchy kořenů.16
• V lokální anestezii 2% lignokain hydrochlorid (Ligox 2%, Indoco Remedies Ltd, Goa, Indie) s použitím čepele č. 15 BP (Bard Parker) bude proveden submarginální řez v bukální části ošetřovaného zubu a prodloužen o 3 mm horizontálně v meziální a distální interdentální gingivě. Na bukálním aspektu postiženého zubu bude proveden intrasulkulární řez. Budou následovat dva šikmé, divergentní uvolňující řezy, přesahující mukogingivální spojení.
• Klapka v plné tloušťce bude zvednuta do MGJ (mukogingivální junkce) pomocí malého periostálního elevátoru. Následně se lalok o částečné tloušťce zvedne za mukogingivální spojení, aby bylo umožněno pasivní koronální posunutí chlopně zcela zakrývající CEJ bez napětí.16
• Kořenové plánování bude provedeno pomocí ostré kyrety. Papily sousedící s ošetřovaným zubem budou deepitelizovány, aby se vytvořila krvácející plocha pro lůžko příjemce, kam bude umístěn SCTG.
• Místo dárce sestávající z 2 mm tlustého palatinového štěpu pojivové tkáně bude odebráno z premoláru do oblasti prvního moláru pomocí techniky „trap door“.14 Štěp pojivové tkáně bude zajištěn v poloze 4-0 absorbovatelnými stehy v místech příjemce.
• Klapky budou stabilizovány slingovou suturou v koronální poloze, následovanou přerušenou suturou při uvolnění řezů v apiko-koronálním směru pomocí 4-0 vstřebatelných stehů.14
• Operační místa budou chráněna neeugenolovým parodontálním obvazem. Pooperační pokyny se budou skládat z 0,2% ústní vody chlorhexidinu 3krát denně po dobu 3 týdnů a Ibuprofenu 600 mg pro kontrolu bolesti po dobu tří dnů. 33
• Stehy budou odstraněny 7 dní po operaci a poté budou pacienti znovu instruováni v mechanickém čištění ošetřených zubů pomocí měkkého zubního kartáčku.33
• Odvolání a posílení pokynů pro ústní hygienu se bude provádět každé 2 měsíce.

Odběr vzorků gingivální krevikulární tekutiny (GCF) a ELISA:

• Subjekty budou pohodlně sedět ve vzpřímené poloze na stomatologickém křesle a vybrané místo bude dobře osvětleno.
• Vzorky GCF budou odebírány po indexu plaku, ale před jakýmkoli jiným klinickým záznamem, který by způsobil podráždění tkáně a kontaminaci vzorku krví.19 Během 4. a 7. dne po chirurgickém sledování bude parodontální obvaz jemně odstraněn a vzorky GCF budou odebrány z gingiválního sulku.
• Po jemném osušení oblasti proudem vzduchu bude supragingivální plak odstraněn, aniž byste se dotkli okrajové gingivy. Oblast bude izolována bavlněnými smotky, aby se zabránilo kontaminaci slinami, a GCF se bude sbírat vložením standardních papírových proužků (perio paper; oraflow Inc., Smithtown, NY, USA) do štěrbiny, dokud neucítíte mírný odpor po dobu 30 sekund.19
• Objem vzorku GCF bude měřen v kalibrovaném přístroji (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM, poté budou naměřené hodnoty převedeny na skutečný objem (µl) odkazem na standardní křivku. Proužky z vybraného místa budou přeneseny v mikrocentrifugovaných zkumavkách obsahujících 200 (µl) fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem.19

Odběr séra:

• Osm mililitrů (8 ml) krve bude odebráno z předloktní jamky ráno po 12 hodinách hladovění pomocí jehly 20 guage s 2 ml injekčními stříkačkami a bude okamžitě přenesena do laboratoře.
• Vzorek krve se nechá srážet při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny, sérum bude extrahováno z krve centrifugací při 3000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut. Vzorek séra bude okamžitě přenesen do plastové lahvičky a skladován při -80 °C až do doby testu34 provedeného pomocí soupravy Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).

Výsledek:

Primárním měřeným výsledkem bude:

• Hladiny MMP-8 v GCF a séru na začátku a následném pooperačním sledování po proceduře CAF+SCTG (4., 7. a 6. měsíc).
• Kvantitativní analýza vzorků GCF na začátku a ve 4., 7. a 6. měsíci po chirurgickém sledování.
• Korelace hodnot GCF a sérové ​​MMP-8 na začátku a 4., 7. a 6. měsíci po chirurgickém sledování.

Sekundární měřený výsledek bude:

1. Indexy hojení ran (WHI) budou hodnoceny 4. a 7. den
2. Hloubka gingivální recese (GRD)
3. Šířka poklesu dásní (GRW)
4. Hloubka sondování (PD)
5. Úroveň klinického připojení (CAL)
6. Apico koronální šířka keratinizované tkáně (KTW)
7. Index plaku, index dásní a index krvácení dásní

Všechny výše uvedené parametry budou korelovat s úrovněmi MMP-8.

Statistická analýza

Získané hodnoty budou porovnány mezi GCF a sérem pomocí testu ANOVA. Průměrné rozdíly v různých časových intervalech od výchozí hodnoty budou testovány samostatně pomocí Mann-Whitney U testu. Hodnota 'p' < 0,05 bude považována za statisticky významnou.