Oszacowanie poziomów MMP-8 w GCF i surowicy oraz ich korelacja z gojeniem się ran i wynikami klinicznymi po zaawansowaniu dokoronowym płata i przeszczepie tkanki łącznej podnabłonkowej w celu pokrycia korzeni w ubytkach recesji: BADANIE KLINICZNO-BIOCHEMICZNE

POTRZEBA NA STUDIUM:

Przesunięty dokoronowo płat z techniką podnabłonkowego przeszczepu tkanki łącznej (CAF+SCTG) okazał się jedną z najskuteczniejszych metod pokrycia korzenia.1 Powodzenie każdego zabiegu chirurgicznego zależy od gojenia się rany.

Gojenie się rany po zabiegu chirurgicznym jest złożonym i wysoce zorganizowanym wydarzeniem, które obejmuje fazę hemostatyczną, fazę zapalną, fazę tworzenia nowej tkanki i ostateczną fazę przebudowy, pozostawiającą bogatą w kolagen macierz zewnątrzkomórkową (ECM) oraz gęstą i stabilną tkankę.2 Podczas gojenia się rany skrzep stanowi podstawę dla przyszłej ECM. ECM odgrywa istotną rolę w przyspieszaniu migracji komórkowej, adhezji, skurczu rany i epitelializacji. Ta kluczowa rola ECM jest utrzymywana przez grupę enzymów znanych jako metaloproteinazy macierzy (MMP). MMP odgrywają kluczową rolę w gojeniu się ran.3,4 Brak regulacji tych MMP został skorelowany z nieprawidłowym gojeniem się ran.3,4 MMP (tj. kolagenazy, żelatynazy, matrylizyny, stromelizyny i MMP typu błonowego) to rodzina endopeptydaz zależnych od cynku, zdolnych do rozszczepiania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w gojących się ranach.3 MMP-8 jest wytwarzana głównie przez neutrofile, a także przez inne komórki, takie jak komórki nabłonka jamy ustnej, komórki plazmatyczne i fibroblasty7. MMP-8 ulega ekspresji podczas mielocytowego etapu rozwoju prekursorów PMN (komórek polimorfojądrowych) w szpiku kostnym29 i jest przechowywany jako utajony enzym (pro-mmp-8) w określonych granulkach PMN.30 Pro-MMP-8 jest szybko uwalniany z aktywowanego PMN przechodzącego degranulację31, a następnie jest aktywowany przez mechanizm przełączania cysteiny, dając aktywną postać enzymu.29 MMP-8 (kolagenaza polimorfojądrowa5) rozszczepia potrójną helisę kolagenu włóknistego i ma powinowactwo do typu I kolagen i kolagen typu III5, który obficie występuje w tkance łącznej dziąseł. MMP-8 degraduje kolagen żelatynowy typu VII, VIII i X.5 Uważa się, że MMP-8 jest ważny dla ostrego gojenia się ran.6 Ważna jest ocena postępu gojenia się rany po operacji. Obecnie stosuje się tępe markery zastępcze, takie jak sondowanie. Ograniczeniem tych znaczników jest to, że reprezentują one historię uzdrowienia, a nie bieżącą aktywność. Ponieważ cechą charakterystyczną gojenia jest przebudowa kolagenu, interesujące jest zbadanie profilu cytokin, który odnosi się do gojenia się ran. Taka wiedza może potencjalnie prowadzić do nowych strategii diagnostycznych do badania gojenia się ran w lepszy sposób odzwierciedlający fenotyp gojenia.

Funkcja kolagenazy podczas normalnego gojenia się ran po zabiegach periodontologicznych została stosunkowo słabo zdefiniowana ze względu na brak badań w tej dziedzinie.10 Większość badań koncentrowała się na charakterystyce MMP-8 w patogenezie chorób przyzębia8 oraz zmianach poziomu MMP-8 po leczeniu periodontologicznym.

Nwomeh i wsp. badali MMP-8 z gojenia się ran skórnych, zbierając wysięk z rany z okluzyjnego bandaża. Zauważył, że MMP-8 osiągnął szczyt w dniu 4 i utrzymywał się przez około tydzień. Nadmierna ekspresja MMP-8 prowadzi do nieprawidłowego gojenia.5 Rany przewlekłe mają 30 razy więcej MMP niż rany ostre. Zahamowanie nadmiernej ekspresji proteaz w tych ranach może pozwolić na prospektywne leczenie gojenia się ran.5 Bardzo mało wiadomo na temat komórkowych aspektów gojenia tkanek miękkich w błonie śluzowej jamy ustnej. Założenie, że gojenie jamy ustnej jest podobne do gojenia się ran skórnych, może wywołać zamieszanie, ponieważ istnieją pewne subtelne różnice, takie jak zmniejszone tworzenie się blizn w ranach skórnych2, rola IL-1 w ranach ustnych i brak IL-1 w ranach skórnych11, szybsze gojenie się ran rany jamy ustnej, obecność śliny, która pomaga w gojeniu itp. Ogólnie rzecz biorąc, różnice w unikalnym schemacie gojenia się ran jamy ustnej są nadal przedmiotem spekulacji i niejasności.

Zrozumienie gojenia się ran na poziomie molekularnym zapewnia dogłębną podstawę do opracowania strategii leczenia, które mogą zapobiegać opóźnionemu gojeniu.2 Zgodnie z zaleceniami zawartymi w raporcie konsensusu z 10. europejskich warsztatów poświęconych periodontologii, że istnieje potrzeba przeprowadzenia większej liczby badań na poziomie komórkowym w celu identyfikacji cytokin, chemokin i wewnątrzkomórkowych sieci sygnałowych w celu uzyskania lepszych metod regeneracyjnych10, zaprojektowano niniejsze badanie kliniczne.

Ze względu na znaczne luki w tym obszarze badań periodontologicznych, niniejsze badanie ma na celu ocenę poziomu MMP-8 podczas gojenia pooperacyjnego po operacji CAF+SCTG w celu pokrycia recesji oraz lepszego rozpoznania mechanizmu gojenia się ran. Informacje te można wykorzystać do zapobiegania zmianom gojenia normalnej rany chirurgicznej.

6.2 PRZEGLĄD LITERATURY: Sanctis et al. (2011) przeprowadzili badanie mające na celu określenie przydatności przeszczepu tkanki łącznej (CTG) w pokryciu korzeni. Wyniki dowiodły, że CAF w połączeniu z SCTG jest właściwym podejściem w leczeniu defektów recesji. Nwomeh et al. (1999) ocenili źródła kolagenaz (MMP-8, MMP-1) i ich aktywność w prawidłowo gojących się ranach i przewlekłych niegojących się owrzodzeniach. Wyniki pokazały, że MMP-8 jest dominującą kolagenazą obecną w normalnie gojących się ranach, a przewlekłe niegojące się owrzodzenia mają podwyższony poziom MMP-1,8 i obniżony poziom TIMP-1 Armstrong i wsp. (2002) dokonali przeglądu kluczowej roli MMP-8 w gojenie się ran jako dominująca kolagenaza. Opracował wyrażenia szczytowych poziomów MMP-8 w dniu 4 i 7 podczas normalnego gojenia się ran.

Hammerle i wsp. (2014) w raporcie konsensusu, w którym dokonali przeglądu biologicznych procesów gojenia się ran tkanek miękkich w jamie ustnej, stwierdzili, że gojenie się tkanek miękkich jamy ustnej zębów, implantów i wyrostka zębodołowego przebiega w tej samej fazie, co gojenie się ran skóry, a dane histologiczne człowieka są ograniczony.

Sorsa i wsp. (2010) porównali w swoich badaniach cztery metody wykrywania metaloproteinazy macierzy płynu dziąsłowego (MMP-8), tj. test immunofluoremetryczny, test zanurzeniowy, test immunoblot dentoAnalyser i zestaw ELISA, i doszli do wniosku, że wszystkie testy są porównywalne, a dentoAnalyser jest wśród pierwszych urządzeń do ilościowego testowania MMP-8 przy fotelu w diagnostyce i badaniach periodontologicznych i okołoimplantologicznych.

Fernandez i wsp. (2007) przeprowadzili badanie w celu zbadania roli MMP_8 w gojeniu się ran skórnych. Zaobserwowali znaczne opóźnienie w zamykaniu ran u myszy MMP-8 -/- i zmienioną odpowiedź zapalną w ich ranach. Wskazali, że MMP-8 uczestniczy w gojeniu się ran poprzez ustąpienie stanu zapalnego i otwiera możliwość opracowania nowych strategii leczenia defektów gojenia się ran.

Mohd H i wsp. (1999)19 ocenili poziomy MMP-8 i MMP-3 podczas wczesnej fazy gojenia po procedurze sterowanej regeneracji tkanek, oceniając próbki GCF (płynu dziąsłowego) w celu ilościowego oznaczenia MMP-8 i MMP-3. Odkryli, że obecność błony wydaje się zwiększać poziomy MMP-3 i -8 i ma związek z resorpcją błony bioresorbowalnej przez układy gospodarza.

Dickinson i wsp. (2013) badali wczesne procesy regeneracji przyzębia w modelu nadpęcherzykowego ubytku przyzębia u psów przy użyciu technik histologicznych i immunologicznych i doszli do wniosku, że aktywacja procesów regeneracyjnych komórek w regeneracji rany przyzębia jest szybka, a ogólne ramy tworzenia tkanki (kość , więzadło ozębnej i tkanka łączna) jest szeroko zarysowana w ciągu 14 dni.

Shaw i wsp. (2009) w skrócie dokonali przeglądu procesu gojenia się ran i opisali złożony proces gojenia się ran. Podkreślił, że przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej odbywa się dzięki delikatnej równowadze MMP.

Teles i wsp. (2010) zmierzyli poziomy biomarkerów GCF i gatunków bakterii poddziąsłowych u osób zdrowych iz zapaleniem przyzębia. Doszedł do wniosku, że klinicznie zdrowe miejsca pobrane od pacjentów z zapaleniem przyzębia wykazują wyższy poziom biomarkerów GCF i patogenów przyzębia niż miejsca pobrane od zdrowych osób.

6.3 Cel badania: Głównym celem tego badania jest ocena efektu i wpływu CAF+SCTG na pokrycie korzeni w miejscach recesji dziąsłowych klasy I i II wg Millera na poziomy MMP-8 w GCF i surowicy.

Celem drugorzędnym jest zbadanie przydatności wyjściowego poziomu MMP-8 w przewidywaniu kategorycznie ocenianych wyników leczenia i skorelowanie go z wczesnym wzorcem gojenia się rany po CAF+SCTG dla pokrycia korzenia.

MATERIAŁY I METODY:

7.1 Źródło danych:

Pacjenci odwiedzający ambulatoryjny oddział periodontologii Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital i spełniający kryteria włączenia i wyłączenia zostaną poddani badaniu przesiewowemu i wybrani do badania.

Projekt eksperymentalny będzie się składał z łącznie 15-20 miejsc, które zostaną zrekrutowane do badania zgodnie z kryteriami włączenia i wyłączenia. Pacjenci zostaną poinformowani o zabiegu chirurgicznym i materiałach użytych do badania oraz uzyskana zostanie od nich świadoma zgoda.

7.2 Sposób zbierania danych:

Wielkość próbki:

To prospektywne badanie będzie pojedynczą ślepą porównawczą kliniczną próbą kontrolną z udziałem 15-20 pacjentów z ubytkami recesji Millera klasy I i II w przednim łuku szczęki.

Technika próbkowania

• Po badaniach przesiewowych w fazie wstępnej każdy pacjent otrzyma instruktaż higieny jamy ustnej, skalingu i planowania korzeni przy pomocy skalerów ultradźwiękowych i kiret manualnych.
• Chirurgiczne leczenie ubytku recesji nie zostanie zaplanowane, dopóki pacjent nie będzie w stanie wykazać odpowiedniego standardu kontroli płytki nazębnej naddziąsłowej (wynik płytki <20% O Leary 1972). Wymienione poniżej parametry kliniczne zostaną zapisane z dokładnością do milimetra przy użyciu sondy UNC-15 (sonda periodontalna University of North Carolina -15 – Hu Friedy, Chicago, IL, USA), a stenty pomiarowe do pozycjonowania sond pomiarowych zostaną wykonane przy użyciu żywica akrylowa utwardzana na zimno na modelu odlewu uzyskanym z wycisku alginianowego. Będzie tak skonstruowany, aby obejmował powierzchnie żujące leczonego zęba oraz powierzchnie żujące co najmniej jednego zęba w kierunku mezjalnym i dystalnym. Zostanie również przedłużony wierzchołkowo na powierzchniach policzkowych i językowych, aby pokryć koronową jedną trzecią zębów. Trzy rowki zostaną zaznaczone na stencie w miejscach mezjalno-policzkowych, środkowo-policzkowych i dystalno-policzkowych jako punkty odniesienia15, tak aby pomiar pooperacyjny był wykonywany w tym samym położeniu i pod takim samym kątem, jak te wykonane przed operacją, tj. pomiary linii bazowej następnie po 6 miesiące.
• Próbka GCF zostanie pobrana z bruzdy dziąsłowej zęba wskazanego do zabiegu pokrycia korzenia (kontrola negatywna) oraz z innego zęba z klinicznie zdrowym dziąsłem (kontrola pozytywna). Próbki będą pobierane na początku badania i podczas późniejszej obserwacji pooperacyjnej (czwarty dzień, siódmy dzień i 6 miesięcy).

Pomiary kliniczne:

Poniższy pomiar kliniczny zostanie zarejestrowany na początku badania i po 6 miesiącach.

1. Głębokość recesji dziąsłowej (GRD), mierzona jako odległość między CEJ a brzegiem dziąsła.17
2. Szerokość recesji dziąsła (GRW), mierzona jako odległość między mezjalnym brzegiem dziąsła a dystalnym brzegiem dziąsła.17
3. Głębokość sondowania (PD), mierzona jako odległość od brzegu dziąsła do podstawy bruzdy dziąsłowej.17
4. Clinical Attachment Level (CAL), pomiar od CEJ (połączenia cementowo-szkliwnego) do podstawy bruzdy dziąsłowej.17
5. Szerokość wierzchołkowo-koronowa tkanki zrogowaciałej (KTW) mierzona jako odległość od połączenia śluzówkowo-dziąsłowego do brzegu dziąsła.17
6. Wskaźniki gojenia się ran (WHI) zostaną ocenione 4 i 7 dnia ( Lien-Hui Huang, 2005)
7. Indeks płytki nazębnej (Sillness and Loe, 1964)
8. Indeks dziąseł (Loe and Sillness, 1963)
9. Wskaźnik krwawienia dziąseł (Ainamo i Bay, 1975)

ZABIEG CHIRURGICZNY:

• Przed rozpoczęciem zabiegu powierzchnie korzeni w pobliżu utraty przyczepu policzkowego zostaną oprzyrządowane mini-five Currettes Gracey Currette, a leczenie mechaniczne zostanie zakończone po uzyskaniu gładkich i twardych powierzchni korzeni.16
• W znieczuleniu miejscowym 2% chlorowodorku lignokainy (Ligox 2%, Indoco Remedies Ltd, Goa, Indie) przy użyciu ostrza nr 15 BP (Bard Parker) zostanie wykonane nacięcie podbrzeżne w policzkowej części leczonego zęba i rozszerzone na 3 mm poziomo w mezjalnym i dystalnym dziąśle międzyzębowym. Nacięcie wewnątrzpęcherzykowe zostanie wykonane w policzkowej części zajętego zęba. Wykonane zostaną dwa ukośne, rozbieżne nacięcia uwalniające, wychodzące poza połączenie śluzówkowo-dziąsłowe.
• Płat o pełnej grubości zostanie podniesiony do MGJ (połączenia śluzówkowo-dziąsłowego) za pomocą małego podnośnika okostnowego. Następnie płatek o częściowej grubości zostanie podniesiony poza połączenie śluzówkowo-dziąsłowe, aby umożliwić bierne koronalne przemieszczenie płatka całkowicie pokrywającego CEJ bez naprężeń.16
• Planowanie korzeni zostanie wykonane za pomocą ostrej łyżeczki. Brodawki sąsiadujące z leczonym zębem zostaną pozbawione nabłonka, aby utworzyć powierzchnię krwawienia dla łóżka biorcy, w którym zostanie umieszczony SCTG.
• Miejsce pobrania, składające się z przeszczepu tkanki łącznej podniebienia o grubości 2 mm, zostanie pobrane od obszaru przedtrzonowego do pierwszego trzonowca przy użyciu techniki „drzwi zapadniowych”.14 Przeszczep tkanki łącznej zostanie zabezpieczony na miejscu za pomocą wchłanialnych szwów 4-0 w miejscach biorczych.
• Płaty zostaną ustabilizowane szwem temblakowym w pozycji koronowej, a następnie szwem przerywanym po zwolnieniu nacięć w kierunku wierzchołkowo-koronowym za pomocą szwów wchłanialnych 4-0.14
• Miejsca operowane będą zabezpieczone opatrunkiem periodontologicznym bez eugenolu. Instrukcje pooperacyjne będą obejmować płukanie ust 0,2% chlorheksydyną 3 razy dziennie przez 3 tygodnie i 600 mg Ibuprofenu do kontroli bólu przez trzy dni. 33
• Szwy zostaną usunięte po 7 dniach od operacji i po tym zabiegu pacjenci zostaną ponownie przeszkoleni w zakresie mechanicznego czyszczenia leczonych zębów miękką szczoteczką.33
• Przypominanie i utrwalanie instrukcji higieny jamy ustnej odbywać się będzie co 2 miesiące.

Pobieranie płynu dziąsłowego (GCF) i test ELISA:

• Pacjenci będą wygodnie siedzieć w pozycji pionowej na fotelu dentystycznym, a wybrane miejsce będzie dobrze oświetlone.
• Próbki GCF będą pobierane po indeksie płytki nazębnej, ale przed wszelkimi innymi zapisami klinicznymi, które mogłyby spowodować podrażnienie tkanek i zanieczyszczenie krwią próbki.19 W 4. i 7. dniu po operacji opatrunek periodontologiczny zostanie delikatnie usunięty, a próbki GCF zostaną pobrane z bruzdy dziąsłowej.
• Po delikatnym osuszeniu obszaru strumieniem powietrza, płytka nazębna naddziąsłowa zostanie usunięta bez dotykania dziąsła brzeżnego. Obszar zostanie odizolowany za pomocą wacików, aby zapobiec zanieczyszczeniu śliną, a GCF zostanie pobrany poprzez włożenie standardowych pasków papieru (papier perio; oraflow Inc., Smithtown, NY, USA) do szczeliny, aż do wyczucia lekkiego oporu przez 30 sekund.19
• Objętość próbki GCF zostanie zmierzona w skalibrowanym urządzeniu (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM, po czym odczyty zostaną przekonwertowane na rzeczywistą objętość (µl) w odniesieniu do krzywej wzorcowej. Paski z wybranego miejsca zostaną przeniesione do mikrowirówkowych probówek zawierających 200 (µl) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.19

Pobieranie próbek surowicy:

• Osiem mililitrów (8 ml) krwi zostanie pobranych z dołu łokciowego po 12-godzinnym poście rano za pomocą igły 20-G i strzykawek 2 ml i zostanie niezwłocznie przesłane do laboratorium.
• Próbkę krwi pozostawia się do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej na jedną godzinę, surowicę ekstrahuje się z krwi przez wirowanie przy 3000 obr./min przez 15 minut. Próbka surowicy zostanie natychmiast przeniesiona do plastikowej fiolki i przechowywana w temperaturze -800C do czasu wykonania testu34 przy użyciu zestawu Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).

Wynik:

Podstawowym mierzonym wynikiem będzie:

• Stężenia MMP-8 w GCF i surowicy na początku badania oraz w dalszej obserwacji pooperacyjnej po zabiegu CAF+SCTG (4., 7. i 6. miesiąc).
• Analiza ilościowa próbek GCF na początku badania oraz 4, 7 i 6 miesięcy po operacji.
• Korelacja wartości GCF i MMP-8 w surowicy na początku badania oraz w 4., 7. i 6. miesiącu po operacji.

Drugim mierzonym wynikiem będzie:

1. Wskaźniki gojenia się ran (WHI) zostaną ocenione w 4. i 7. dniu
2. Głębokość recesji dziąsła (GRD)
3. Szerokość recesji dziąsła (GRW)
4. Głębokość sondowania (PD)
5. Poziom przyczepności klinicznej (CAL)
6. Szerokość wierzchołkowa tkanki zrogowaciałej (KTW)
7. Indeks płytki nazębnej, Indeks dziąseł i Indeks krwawienia dziąseł

Wszystkie powyższe parametry będą skorelowane z poziomami MMP-8.

Analiza statystyczna

Otrzymane wartości zostaną porównane między GCF a surowicą za pomocą testu ANOVA. Średnie różnice w różnych odstępach czasu od wartości wyjściowej będą badane oddzielnie za pomocą testu U Manna-Whitneya. Wartość „p” < 0,05 będzie uważana za istotną statystycznie.