Estimering av MMP-8-nivåer i GCF og serum og dets korrelasjon med sårheling og kliniske utfall etter koronalt avansert klaff og subepitelial bindevevstransplantasjon for rotdekning i resesjonsdefekter: EN KLINIKO-BIOKJEMISK STUDIE

BEHOV FOR STUDIE:

Koronalt avansert klaff med subepitelial bindevevsgraft (CAF+SCTG) teknikk har vist seg å være en av de mest vellykkede modalitetene for rotdekning.1 Suksessen til enhver kirurgisk prosedyre er avhengig av sårheling.

Sårheling etter kirurgisk prosedyre er en kompleks og svært orkestrert hendelse som inkluderer hemostatisk fase, inflammatorisk fase, fase med ny vevsdannelse og den siste remodelleringsfasen som etterlater kollagenrik ekstracellulær matrise (ECM) og et tett og stabilt vev.2 Under sårheling gir koagel et grunnlag for fremtidens ECM. ECM spiller en viktig rolle for å fremkalle cellulær migrasjon, adhesjon, sårkontraksjon og epitelisering. Denne avgjørende rollen til ECM opprettholdes av en gruppe enzymer samlet kjent som Matrix Metalloproteinases (MMPs). MMP spiller en sentral rolle i sårheling.3,4 Svikt i regulering av disse MMP-ene har vært korrelert med feil sårheling.3,4 MMP-er (dvs. kollagenaser, gelatinaser, matrilysiner, stromelysiner og MMP-er av membrantype) er familie av sinkavhengige endopeptidaser som er i stand til å spalte ekstracellulær matrise (ECM) i helbredende sår.3 MMP-8 produseres primært av nøytrofiler og produseres også av andre celler som orale epitelceller, plasmaceller og fibroblaster.7 MMP-8 kommer til uttrykk under det myelocytiske utviklingsstadiet av PMN (polymorfonukleær celle) forløpere i benmargen29 og lagres som latent enzym (pro-mmp-8) i de spesifikke granulatene til PMN.30 Pro-MMP-8 frigjøres raskt fra aktivert PMN som gjennomgår degranulering31 og aktiveres deretter via cysteinbrytermekanisme for å gi den aktive formen av enzym.29 MMP-8 (polymorfonukleær kollagenase5) spalter trippelhelixen til fibrillært kollagen og har affinitet for type I kollagen og type III kollagen5 som finnes rikelig i bindevev til gingiva. MMP-8 bryter ned gelatin type VII, VIII og X kollagen.5 MMP-8 har blitt implisert å være viktig for akutt sårheling.6 Vurdering av sårhelingsprogresjon etter operasjon er viktig. For tiden brukes butte surrogatmarkører som sondering. Begrensningen til disse markørene er at de representerer historien om helbredelse og ikke den pågående aktiviteten. Siden kjennetegn på helbredelse er kollagen-remodellering, er det av interesse å studere cytokinprofilen som er relatert til sårheling. Slik kunnskap kan potensielt føre til nye diagnostiske strategier for å studere sårtilheling på en bedre måte som gjenspeiler tilhelingsfenotypen.

Funksjonen til kollagenase under normal sårheling etter periodontal kirurgi har vært relativt dårlig definert på grunn av mangel på studier på dette området.10 Mesteparten av forskningen har konsentrert seg om karakterisering av MMP-8 under patogenesen av periodontal sykdom8 og endringene i MMP-8-nivået etter periodontal behandling.

Nwomeh et al studerte MMP-8 fra dermal sårheling ved å samle såreksudat fra okklusiv bandasje. Han bemerket at MMP-8 nådde toppen på dag 4 og vedvarte i omtrent en uke. MMP-8 overekspresjon fører til feiltilheling.5 Kroniske sår har 30 ganger større MMP enn akutte sår. Hemming av overdreven proteaseekspresjon i disse sårene kan tillate en potensiell sårhelingsbehandling.5 Svært mindre er kjent om de cellulære aspektene ved tilheling av bløtvev i munnslimhinnen. Antakelsen om at oral tilheling ligner på dermale sår kan provosere forvirring, ettersom det er visse subtile forskjeller som redusert arrdannelse i hudsår2, rollen til IL-1 i orale sår og fravær av IL-1 i hudsår11, raskere tilheling i orale sår, tilstedeværelse av spytt som hjelper til med tilheling osv. Totalt sett er det fortsatt et spørsmål om spekulasjoner og tvetydighet om forskjellene i det unike tilhelingsmønsteret til orale sår.

Å forstå sårtilheling på molekylært nivå gir et dyptgående grunnlag for å utvikle behandlingsstrategier som kan forhindre forsinket tilheling.2 Som anbefalt av konsensusrapport fra 10. europeiske workshop om periodontologi om at det er behov for flere studier på cellenivå for å identifisere cytokin-, kjemokin- og intracellulære signalnettverk for bedre regenerative tilnærminger10, ble den nåværende kliniske studien designet.

På grunn av en betydelig lakune i dette området av periodontal forskning, er denne studien planlagt for å vurdere MMP-8-nivåene under post-op-heling etter CAF+SCTG-kirurgi for resesjonsdekning og for å bedre identifisere mekanismen involvert i sårheling. Denne informasjonen kan brukes til å forhindre at det normale operasjonssåret endrer helingsopplevelsen.

6.2 LITTERATURGJENNOMGANG: Sanctis et al. (2011) utførte en studie for å bestemme bruken av bindevevstransplantat (CTG) i rotdekning. Resultatene viste at CAF i assosiasjon med SCTG er en gyldig tilnærming i behandlingen av resesjonsdefekter Nwomeh et al. (1999) vurderte kildene til kollagenaser (MMP-8, MMP-1) og deres aktivitet i normale helbredende sår og kroniske ikke-helende sår. Resultatene viste at MMP-8 er dominerende kollagenase tilstede i normale helbredende sår og kroniske ikke-helende sår hadde økt nivå av MMP-1,8 og reduserte nivåer av TIMP-1 Armstrong et al (2002) gjennomgikk nøkkelrollen til MMP-8 i sårheling som dominerende kollagenase. Han utdypet uttrykkene for toppnivåer av MMP-8 på dag 4 og 7 under normal sårheling.

Hammerle et al (2014) fant i en konsensusrapport som gjennomgikk de biologiske prosessene for sårheling av bløtvev i munnhulen at muntlig bløtvevsheling ved tenner, implantater og tannrygg følger samme fase som hudsårtilheling og humane histologiske data er begrenset.

Sorsa et al (2010) sammenlignet fire metoder for deteksjon av gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase (MMP-8), dvs. immunofluorometerisk assay, dip stick test, dentoAnalyser immunoblot assay og ELISA kit i deres studie og konkluderte med at alle analysene er sammenlignbare og dentoAnalyser er blant første kvantitative MMP-8 stolsidetestingsenheter innen periodontal og periimplantatdiagnostikk og forskning.

Fernandez et al (2007) gjennomførte en studie for å undersøke rollen til MMP_8 i kutan sårheling. De observerte betydelig forsinkelse i sårlukking hos MMP-8 -/- mus og en endret inflammatorisk respons i sårene deres. De indikerte at MMP-8 deltar i sårreparasjon ved å løse opp betennelse og åpner muligheten for å utvikle nye strategier for behandling av sårhelingsdefekter.

Mohd H et al (1999)19 vurderte nivåene av MMP-8 og MMP-3 under tidlig helingsfase etter en veiledet vevsregenereringsprosedyre ved å vurdere GCF (Gingival Crevicular Fluid) prøver for kvantifisering av MMP-8 og MMP-3. De fant at tilstedeværelsen av membranen så ut til å øke nivåene av MMP-3 og -8 og forholde seg til resorpsjonen av den bioresorberbare membranen av vertssystemer.

Dickinson et al (2013) studerte de tidlige hendelsene i periodontal regenerering i hundens supraalveolære periodontale defektmodell ved å bruke histologiske og immunologiske teknikker og konkluderte med at aktivering av cellulære regenerative hendelser i periodontal sårregenerering er rask, det generelle rammeverket for vevsdannelse ( bein , periodontal ligament og bindevev) er bredt skissert innen 14 dager.

Shaw et al (2009) gjennomgikk sårreparasjon på et øyeblikk og beskrev den komplekse prosessen med sårreparasjon. Han la vekt på at ombyggingen av ekstracellulær matrise oppnås ved en delikat balanse av MMP-er.

Teles et al (2010) målte nivåene av GCF-biomarkører og subgingivale bakteriearter hos periodontalt friske og periodontitt-personer. Han konkluderte med at klinisk sunne steder fra periodontitt-personer viser høyere nivåer av GCF-biomarkører og periodontale patogener enn steder fra friske personer.

6.3 Mål for studien: Hovedmålet med denne studien er å evaluere effekten og virkningen av CAF+SCTG for rotdekning i Millers klasse I og II gingival resesjonssteder på MMP-8-nivåene i GCF og serum.

Det sekundære målet er å teste nytten av basislinje MMP-8-nivå for å forutsi kategorisk vurderte behandlingsresultater og korrelere det med tidlig sårhelingsmønster etter CAF+SCTG for rotdekning.

MATERIALER OG METODER:

7.1 Datakilde:

Pasienter som besøker poliklinisk avdeling for periodontologi, Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital og som tilfredsstiller inklusjons- og eksklusjonskriteriene, vil bli screenet og valgt ut for studien.

Det eksperimentelle designet vil bestå av totalt 15-20 nettsteder som vil bli rekruttert til studien i henhold til inklusjons- og eksklusjonskriteriene. Pasientene vil bli informert om den kirurgiske prosedyren og materialene som brukes til studien, og det vil bli innhentet et informert samtykke fra pasientene.

7.2 Metode for innsamling av data:

Eksempelstørrelse:

Denne prospektive studien vil være en enkelt blind sammenlignende klinisk kontrollstudie med 15-20 pasienter som har Millers klasse I og II resesjonsdefekter i den fremre kjevebuen.

Prøvetakingsteknikk

• Etter screeningundersøkelser i startfasen vil hvert forsøksperson få en økt med munnhygieneinstruksjoner, skalering og rotplanlegging med ultralydskalere og manuelle kyretter.
• Kirurgisk behandling av resesjonsdefekt vil ikke bli planlagt før pasienten kan demonstrere en adekvat standard for supragingival plakkkontroll (plakkscore <20 % O Leary 1972). De nedenfor nevnte kliniske parametrene vil bli registrert til nærmeste millimeter ved hjelp av en UNC-15-probe (University of North Carolina -15 periodontal probe -Hu Friedy, Chicago, IL, USA) og måle okklusale stenter for posisjonering av måleprober vil bli produsert med kaldherdet akrylharpiks på en støpt modell hentet fra et alginatavtrykk. Den vil være konstruert slik at den dekker okklusalflatene på tannen som behandles og okklusalflatene til minst én tann i mesial og distal retning. Den vil også utvides apikalt på bukkal- og lingualflatene for å dekke den koronale tredjedelen av tennene. Tre spor vil merkes på stenten ved mesio-bukkale, midtbukkale og disto-bukkale steder som referansepunkter15 slik at postkirurgiske målinger vil bli utført i samme posisjon og vinkling som de som ble gjort før operasjonen, dvs. baseline-målinger og deretter etter 6. måneder.
• GCF-prøven vil bli tatt fra gingival sulcus av tannen indisert for rotdekningsprosedyre (negativ kontroll) og fra en annen tann med klinisk sunn gingiva (positiv kontroll). Prøvene vil bli tatt ved baseline og ved påfølgende postkirurgisk oppfølging (fjerde dag, syvende dag og 6 måneder).

Kliniske målinger:

Følgende kliniske målinger vil bli registrert ved baseline og etter 6 måneder.

1. Gingival resesjonsdybde (GRD), målt som avstanden mellom CEJ og gingival margin.17
2. Gingival Recession Width (GRW), målt som avstanden mellom mesial gingival margin og distal gingival margin.17
3. Probing Depth (PD), målt som avstanden fra gingival margin til bunnen av gingival sulcus.17
4. Clinical Attachment Level (CAL), måling fra CEJ ( Cementoenamel junction) til bunnen av gingival sulcus.17
5. Apico koronal bredde av keratinisert vev (KTW) målt som avstanden fra mucogingival junction til gingival margin.17
6. Sårhelingsindekser (WHI) vil bli vurdert på 4. og 7. dag (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Plaque Index (Sillness and Loe, 1964)
8. Gingival Index (Loe og Sillness, 1963)
9. Gingival blødningsindeks (Ainamo og Bay, 1975)

KIRURGISK PROSEDYRE:

• Før operasjonen starter, vil rotoverflater nær bukkal festetap bli instrumentert med mini-fem Gracey Currettes, og den mekaniske behandlingen vil bli avsluttet når glatte og harde rotoverflater vil bli oppnådd.16
• Under lokalbedøvelse 2 % lignokainhydroklorid (Ligox 2 %, Indoco Remedies Ltd, Goa, India) ved bruk av et nr. 15 BP (Bard Parker) blad, vil et submarginalt snitt bli gjort ved den bukkale siden av den behandlede tannen og forlenget 3 mm horisontalt i den mesiale og distale interdentale gingiva. Et intrasulkulært snitt vil bli gjort ved det bukkale aspektet av den involverte tannen. To skrå, divergerende frigjørende snitt vil bli fulgt, som strekker seg utover mukogingivalkrysset.
• En klaff i full tykkelse vil bli hevet til MGJ (mucogingival junction) ved hjelp av en liten periosteal elevator. Deretter vil en klaff med delvis tykkelse heves utover mukogingivalkrysset for å tillate en passiv koronal forskyvning av klaffen som fullstendig dekker CEJ uten spenning.16
• Rotplanlegging vil bli gjort ved hjelp av en skarp curette. Papillene ved siden av den behandlede tannen vil bli de-epitelisert for å skape en blødende overflate for en mottakerseng, hvor SCTG vil bli plassert.
• Donorstedet som består av 2 mm tykt palatal bindevevstransplantat vil bli høstet fra premolar til første molare område ved hjelp av "felledør"-teknikken.14 Bindevevstransplantatet vil bli sikret på plass med 4-0 absorberbare suturer på mottakersteder.
• Klaffene vil bli stabilisert med slyngesut i koronal stilling, etterfulgt av avbrutt sutur ved frigjøring av snitt i apiko-koronal retning ved bruk av 4-0 absorberbare suturer.14
• Operasjonsstedene vil bli beskyttet med en ikke-eugenol periodontal bandasje. Postoperative instruksjoner vil bestå av 0,2 % klorheksidin munnskylling 3 ganger daglig i 3 uker og Ibuprofen 600 mg for smertekontroll i tre dager. 33
• Suturer vil bli fjernet 7 dager etter operasjonen og etter dette vil pasientene bli instruert i mekanisk rengjøring av behandlede tenner med bruk av myk tannbørste.33
• Tilbakekalling og forsterkning av munnhygieneinstruksjoner vil bli gjort annenhver måned.

Gingival crevicular fluid (GCF) prøvetaking og ELISA:

• Forsøkspersonene vil sitte komfortabelt i oppreist stilling på tannlegestolen, og det valgte stedet vil være godt opplyst.
• GCF-prøver vil bli samlet inn etter plakkindeks, men før andre kliniske registreringer som kan forårsake vevsirritasjon og blodkontaminering av prøven.19 I løpet av den 4. og 7. dagen etter kirurgisk oppfølging, vil periodontalbandasjen bli forsiktig fjernet og GCF-prøver vil bli samlet fra tannkjøttsulcus.
• Etter forsiktig tørking av området med et støt av luft, vil supragingival plakk fjernes uten å berøre den marginale gingiva. Området vil bli isolert med bomullsruller for å forhindre spyttkontaminering, og GCF vil bli samlet opp ved å sette inn standard papirstrimler (perio-papir; oraflow Inc., Smithtown, NY, USA) inn i sprekken til mild motstand merkes i 30 sekunder.19
• GCF-prøvevolumet vil bli målt i et kalibrert apparat (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM, hvoretter avlesningene vil bli konvertert til et faktisk volum (µl) ved referanse til standardkurven. Strimlene fra det valgte stedet vil bli overført i mikrosentrifugerte rør som inneholder 200 (µl) fosfatbuffer saltvann.19

Serumprøvetaking:

• Åtte milliliter (8 ml) blod vil bli samlet fra antecubital fossa etter 12 timers faste om morgenen ved bruk av 20-gage nål med 2 ml sprøyter og vil umiddelbart bli overført til laboratoriet.
• Blodprøven får koagulere ved romtemperatur i én time, serum vil bli ekstrahert fra blod ved sentrifugering ved 3000 rpm i 15 minutter. Serumprøven vil umiddelbart overføres til hetteglass av plast og lagres ved -800C til tidspunktet for analyse34 utført ved bruk av Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-sett.

Utfall:

Det primære målte resultatet vil være:

• MMP-8-nivåer i GCF og serum ved baseline og påfølgende postkirurgisk oppfølging etter CAF+SCTG-prosedyre (4., 7. og 6. måned).
• Kvantitativ analyse av GCF-prøver ved baseline og 4., 7. og 6 måneder etter kirurgisk oppfølging.
• Korrelasjon av GCF og serum MMP-8 verdier ved baseline og 4., 7. og 6 måneder etter kirurgisk oppfølging.

Det sekundære resultatet som måles vil være:

1. Sårhelingsindekser (WHI) vil bli vurdert på 4. og 7. dag
2. Gingival resesjonsdybde (GRD)
3. Gingival resesjonsbredde (GRW)
4. Probing Depth (PD)
5. Klinisk tilknytningsnivå (CAL)
6. Apico koronal bredde av keratinisert vev (KTW)
7. Plakkindeks, Gingival Index og Gingival Bleeding Index

Alle parametrene ovenfor vil være korrelert med MMP-8-nivåene.

Statistisk analyse

De oppnådde verdiene vil bli sammenlignet mellom GCF og serum ved bruk av ANOVA-test. Gjennomsnittlige forskjeller ved forskjellige tidsintervaller fra grunnlinjeverdien vil bli testet med Mann-Whitney U-test separat. En 'p'-verdi på < 0,05 vil bli ansett som statistisk signifikant.