GCF 和血清中 MMP-8 水平的估计及其与冠状高级皮瓣和上皮下结缔组织移植后牙根覆盖后缺损的伤口愈合和临床结果的相关性：一项临床生物化学研究

研究需要：

上皮下结缔组织移植 (CAF+SCTG) 技术的冠状高级皮瓣已被证明是最成功的牙根覆盖方式之一。 1 任何外科手术的成功都取决于伤口的愈合。

外科手术后的伤口愈合是复杂且高度协调的事件，包括止血阶段、炎症阶段、新组织形成阶段和最终重塑阶段，留下富含胶原蛋白的细胞外基质 (ECM) 和致密稳定的组织。 2 在伤口愈合过程中，凝块为未来的 ECM 奠定了基础。 ECM 在促进细胞迁移、粘附、伤口收缩和上皮化方面起着至关重要的作用。 ECM 的这一关键作用由一组统称为基质金属蛋白酶 (MMP) 的酶维持。 MMP 在伤口愈合中起着核心作用。 3,4 这些 MMP 的调节失败与伤口愈合不良有关。 3,4 MMP（即 胶原酶、明胶酶、基质溶素、基质溶素和膜型基质金属蛋白酶）是锌依赖性内肽酶家族，能够在愈合伤口中切割细胞外基质 (ECM)。 3 MMP-8 主要由中性粒细胞产生，也由其他细胞产生，例如口腔上皮细胞、浆细胞和成纤维细胞。7 MMP-8 在骨髓中 PMN（多形核细胞）前体的髓细胞发育阶段表达 29 和以潜在酶 (pro-mmp-8) 的形式储存在 PMN.30 的特定颗粒中 Pro-MMP-8 从正在脱粒的活化 PMN 中快速释放 31，然后通过半胱氨酸开关机制被激活，产生酶的活性形式。 29 MMP-8（多形核胶原酶 5）切割纤维胶原的三股螺旋并对 I 型具有亲和力胶原蛋白和 III 型胶原蛋白5，大量存在于牙龈的结缔组织中。 MMP-8 降解明胶 VII、VIII 和 X 型胶原蛋白。 5 MMP-8 被认为对急性伤口愈合很重要。 6 手术后伤口愈合进展的评估很重要。 目前使用钝性替代标记，例如探测。 这些标记的局限性在于它代表了愈合的历史而不是正在进行的活动。 由于愈合的标志是胶原重塑，因此研究与伤口愈合相关的细胞因子谱很有意义。 这些知识可能会导致新的诊断策略，以更好地反映愈合表型的方式研究伤口愈合。

由于缺乏这方面的研究，胶原酶在牙周手术后正常伤口愈合过程中的功能相对不明确。 10 大多数研究集中在牙周病发病机制中 MMP-8 的表征 8 和牙周治疗后 MMP-8 水平的变化。

Nwomeh 等人通过收集封闭绷带的伤口渗出液研究了真皮伤口愈合过程中的 MMP-8。 他注意到 MMP-8 在第 4 天达到峰值并持续了大约一周。 MMP-8 过度表达会导致愈合不良。5 慢性伤口的 MMP 比急性伤口高 30 倍。 抑制这些伤口中过度的蛋白酶表达可能会带来前瞻性的伤口愈合治疗。 5 关于口腔粘膜软组织愈合的细胞方面知之甚少。 认为口腔愈合类似于真皮伤口的假设可能会引起混淆，因为存在某些细微差别，例如真皮伤口疤痕形成减少 2、IL-1 在口腔伤口中的作用以及真皮伤口中没有 IL-111、伤口愈合更快口腔伤口，唾液的存在有助于愈合等。总的来说，关于口腔伤口独特愈合模式的差异仍然是一个猜测和模棱两可的问题。

在分子水平上了解伤口愈合为制定可防止延迟愈合的治疗策略提供了深入的基础。 2 正如第 10 届欧洲牙周病学研讨会的共识报告所建议的那样，需要在细胞水平上进行更多研究，以确定细胞因子、趋化因子和细胞内信号网络，以获得更好的再生方法 10，因此设计了本临床试验。

由于牙周研究这一领域存在相当大的空白，本研究计划评估 CAF+SCTG 手术后愈合期间的 MMP-8 水平以覆盖衰退，并更好地确定伤口愈合所涉及的机制。 该信息可用于防止正常手术伤口的愈合体验发生改变。

6.2 文献回顾：Sanctis 等人。 (2011) 进行了一项研究，以确定结缔组织移植物 (CTG) 在牙根覆盖中的应用。 结果证明 CAF 联合 SCTG 是治疗衰退缺陷的有效方法 Nwomeh 等人。 (1999) 评估了胶原酶（MMP-8、MMP-1）的来源及其在正常愈合伤口和慢性未愈合溃疡中的活性。 结果表明，MMP-8 是正常愈合伤口中主要存在的胶原酶，慢性未愈合溃疡的 MMP-1,8 水平升高，TIMP-1 水平降低 Armstrong 等人（2002 年）回顾了 MMP-8 在愈合过程中的关键作用伤口愈合作为主要的胶原酶。 他详细阐述了正常伤口愈合过程中第 4 天和第 7 天的 MMP-8 峰值水平的表达。

Hammerle 等人 (2014) 在一份回顾口腔软组织伤口愈合生物学过程的共识报告中发现，牙齿、种植体和无牙槽嵴的口腔软组织愈合遵循与皮肤伤口愈合相同的阶段，人体组织学数据显示有限的。

Sorsa 等人 (2010) 在他们的研究中比较了四种牙龈沟液基质金属蛋白酶 (MMP-8) 检测方法，即免疫荧光测定法、浸渍棒试验、dentoAnalyser 免疫印迹测定法和 ELISA 试剂盒，并得出结论认为所有测定法都具有可比性，dentoAnalyser 是是牙周和种植体周围诊断和研究中首批定量 MMP-8 椅边测试设备之一。

Fernandez 等人 (2007) 进行了一项研究，以调查 MMP_8 在皮肤伤口愈合中的作用。 他们观察到 MMP-8 -/- 小鼠的伤口闭合显着延迟以及伤口炎症反应的改变。 他们指出，MMP-8 通过消除炎症参与伤口修复，并为开发治疗伤口愈合缺陷的新策略提供了可能性。

Mohd H 等人 (1999)19 通过评估 GCF（牙龈缝隙液）样本对 MMP-8 和 MMP-3 进行量化，从而在引导组织再生程序后的早期愈合阶段评估 MMP-8 和 MMP-3 的水平。 他们发现膜的存在似乎会增加 MMP-3 和 -8 的水平，并且与宿主系统对生物可吸收膜的再吸收有关。

Dickinson 等人 (2013) 通过使用组织学和免疫学技术研究了犬牙槽上牙周缺损模型中牙周再生的早期事件，并得出结论，牙周伤口再生中细胞再生事件的激活是快速的，组织形成的一般框架（骨、牙周韧带和结缔组织）在 14 天内大致勾勒出轮廓。

Shaw 等人 (2009) 对伤口修复进行了概览，描述了伤口修复的复杂过程。 他强调，细胞外基质的重塑是通过基质金属蛋白酶的微妙平衡来完成的。

Teles 等人 (2010) 测量了牙周健康和牙周炎受试者的 GCF 生物标志物和龈下细菌种类的水平。 他得出结论，牙周炎受试者的临床健康部位比健康受试者的部位具有更高水平的 GCF 生物标志物和牙周病原体。

6.3 研究目的： 本研究的主要目的是评估 CAF+SCTG 对 Millers I 类和 II 类牙龈退缩部位牙根覆盖对 GCF 和血清中 MMP-8 水平的影响。

次要目标是测试基线 MMP-8 水平在预测明确评估的治疗结果中的效用，并将其与 CAF+SCTG 后根部覆盖的早期伤口愈合模式相关联。

材料和方法：

7.1 数据来源：

到 Krishnadevaraya 牙科科学学院和医院牙周病门诊就诊并满足纳入和排除标准的患者将被筛选和选择用于研究。

实验设计将由总共 15-20 个地点组成，他们将根据纳入和排除标准被招募用于研究。 患者将被告知用于研究的手术程序和材料，并且将从患者那里获得知情同意书。

7.2 数据收集方法：

样本量：

这项前瞻性研究将是一项单盲比较临床对照试验，纳入 15-20 名患有上颌前牙弓 Miller I 级和 II 级退缩缺陷的患者。

取样技术

• 在初始阶段的筛选检查后，每位受试者将接受一次口腔卫生指导、使用超声波洁牙机和手动刮匙进行洁治和牙根规划。
• 在患者能够证明龈上菌斑控制达到足够标准（菌斑评分 <20% O Leary 1972）之前，不会安排退缩缺损的手术治疗。 下面提到的临床参数将使用 UNC-15 探针（北卡罗来纳大学 -15 牙周探针 - Hu Friedy，芝加哥，伊利诺伊州，美国）记录到最接近的毫米，并将制造用于定位测量探针的测量咬合支架从藻酸盐印模中获得的铸造模型上的冷固化丙烯酸树脂。 它将被构造成覆盖被治疗牙齿的咬合面以及至少一颗牙齿在近中和远中方向上的咬合面。 它还将在颊侧和舌侧表面向根尖延伸，以覆盖牙齿的冠状三分之一。 将在近颊、中颊和远颊位置的支架上标记三个凹槽作为参考点15，以便在与手术前相同的位置和角度进行手术后测量，即基线测量，然后在 6个月。
• GCF 样品将从指示用于牙根覆盖程序（阴性对照）的牙齿的牙龈沟和具有临床健康牙龈的另一颗牙齿（阳性对照）收集。 样本将在基线和随后的手术后随访（第四天、第七天和 6 个月）时收集。

临床测量：

将在基线和 6 个月后记录以下临床测量值。

1. 牙龈退缩深度 (GRD)，测量为 CEJ 和牙龈边缘之间的距离。 17
2. 牙龈退缩宽度 (GRW)，测量为近中牙龈边缘和远中牙龈边缘之间的距离。 17
3. 探诊深度 (PD)，测量为从牙龈边缘到牙龈沟底部的距离。 17
4. 临床附着水平 (CAL)，从 CEJ（牙骨质交界处）到牙龈沟底部的测量值。17
5. 角化组织的顶端冠状宽度 (KTW) 测量为从粘膜龈交界处到龈缘的距离。 17
6. 伤口愈合指数 (WHI) 将在第 4 天和第 7 天进行评估（Lien-Hui Huang，2005）
7. 牙菌斑指数（Sillness 和 Loe，1964 年）
8. 牙龈指数（Loe 和 Sillness，1963 年）
9. 牙龈出血指数（Ainamo 和 Bay，1975 年）

手术过程：

• 在开始手术之前，靠近颊侧附着缺失的牙根表面将使用微型五种 Gracey Currettes 进行器械治疗，当获得光滑而坚硬的牙根表面时，将终止机械治疗。 16
• 在使用 15 号 BP（Bard Parker）刀片的 2% 盐酸利多卡因（Ligox 2%，Indoco Remedies Ltd, Goa, India）局部麻醉下，将在治疗牙齿的颊侧做一个边缘下切口并延长 3 mm水平分布于近中和远中牙间龈。 将在相关牙齿的颊侧进行沟内切口。 将遵循两个倾斜的、发散的释放切口，延伸到膜龈交界处之外。
• 使用小型骨膜提升器将全层皮瓣提升至 MGJ（粘膜龈交界处）。 随后，将一个部分厚度的皮瓣抬高到膜龈交界处以外，以允许皮瓣被动冠状移位，完全覆盖 CEJ 而没有张力。 16
• 根部规划将使用锋利的刮匙完成。与治疗牙齿相邻的乳突将被去上皮化，为受体床创造一个出血表面，SCTG 将放置在该表面上。
• 供体部位由 2 毫米厚的腭结缔组织移植物组成，将使用“活板门”技术从前磨牙到第一磨牙区域采集。 14 结缔组织移植物将在受体部位用 4-0 可吸收缝线固定到位。
• 皮瓣将在冠状位置用吊带缝合稳定，然后使用 4-0 可吸收缝线在根尖冠状方向上松开切口时中断缝合。 14
• 手术部位将使用非丁香酚牙周敷料进行保护。 术后指导将包括 0.2% 氯己定漱口水，每天 3 次，持续 3 周，以及布洛芬 600 毫克用于控制疼痛，持续三天。 33
• 手术后 7 天将拆除缝合线，之后将重新指导患者使用软牙刷对治疗过的牙齿进行机械清洁。 33
• 口腔卫生说明的召回和强化将每 2 个月进行一次。

龈沟液 (GCF) 取样和 ELISA：

• 受试者将舒适地坐在牙科椅上的直立位置，并且选定的位置将被很好地照亮。
• GCF 样本将在菌斑指数之后但在任何其他可能导致样本组织刺激和血液污染的临床记录之前收集。 19 在术后第 4 天和第 7 天，轻轻去除牙周敷料，并从牙龈沟中采集 GCF 样本。
• 用一股空气轻轻吹干该区域后，将去除龈上菌斑而不接触边缘牙龈。 该区域将用棉卷隔离以防止唾液污染，并且通过将标准纸条（perio 纸；oraflow Inc., Smithtown, NY, USA）插入缝隙直到感觉到轻微阻力 30 秒来收集 GCF。 19
• GCF 样品体积将在校准器具（Periotron 8000 Proflow Inc.，Amityville，NY，USA）TM 中测量，之后将参考标准曲线将读数转换为实际体积（μl）。 来自选定位点的条带将转移到含有 200(µl) 磷酸盐缓冲盐水的微量离心管中。 19

血清取样：

• 早上禁食 12 小时后，将使用带有 2 毫升注射器的 20 号针头从肘窝采集八毫升（8 毫升）血液，并将立即转移到实验室。
• 血液样本将在室温下凝结一小时，通过以 3000 rpm 离心 15 分钟从血液中提取血清。 血清样品将立即转移到塑料瓶中并储存在 -800C 下，直到使用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒进行测定34。

结果：

衡量的主要结果将是：

• CAF+SCTG 手术后（第 4、7 和 6 个月）基线和随后的术后随访时 GCF 和血清中的 MMP-8 水平。
• 在基线和手术后第 4、7 和 6 个月随访时对 GCF 样本进行定量分析。
• 基线和术后第 4、7 和 6 个月 GCF 与血清 MMP-8 值的相关性。

测量的次要结果将是：

1. 伤口愈合指数 (WHI) 将在第 4 天和第 7 天进行评估
2. 牙龈退缩深度 (GRD)
3. 牙龈退缩宽度 (GRW)
4. 探测深度 (PD)
5. 临床依恋水平 (CAL)
6. 角化组织的顶端冠状宽度 (KTW)
7. 菌斑指数、牙龈指数和牙龈出血指数

所有上述参数都与 MMP-8 水平相关。

统计分析

获得的值将使用 ANOVA 测试在 GCF 和血清之间进行比较。 不同时间间隔与基线值的平均差异将分别使用 Mann-Whitney U 检验进行测试。 < 0.05 的“p”值将被视为具有统计学意义。