Estimativa dos níveis de MMP-8 em GCF e soro e sua correlação com cicatrização de feridas e resultados clínicos após retalho coronalmente avançado e enxerto de tecido conjuntivo subepitelial para cobertura de raiz em defeitos de recessão: UM ESTUDO CLÍNICO-BIOQUÍMICO

NECESSIDADE DO ESTUDO:

Retalho avançado coronalmente com técnica de Enxerto de Tecido Conjuntivo Subepitelial (CAF+SCTG) provou ser uma das modalidades mais bem-sucedidas para cobertura radicular.1 O sucesso de qualquer procedimento cirúrgico depende da cicatrização da ferida.

A cicatrização de feridas após o procedimento cirúrgico é um evento complexo e altamente orquestrado que inclui a fase hemostática, a fase inflamatória, a fase de formação de novos tecidos e a fase final de remodelação, deixando para trás uma matriz extracelular (MEC) rica em colágeno e um tecido denso e estável.2 Durante a cicatrização de feridas, o coágulo fornece uma base para o futuro ECM. ECM desempenha um papel vital para estimular a migração celular, adesão, contração da ferida e epitelização. Este papel crucial da ECM é mantido por um grupo de enzimas conhecidas coletivamente como Matrix Metalloproteinases (MMPs). As MMPs desempenham um papel central na cicatrização de feridas.3,4 A falha na regulação dessas MMPs foi correlacionada com cicatrização defeituosa.3,4 MMPs (ou seja, colagenases, gelatinases, matrilisinas, estromelisinas e MMPs do tipo membrana) são uma família de endopeptidases dependentes de zinco capazes de clivar a matriz extracelular (ECM) na cicatrização de feridas.3 As MMP-8 são produzidas principalmente por neutrófilos e também são produzidas por outras células, como células epiteliais orais, células plasmáticas e fibroblastos.7 A MMP-8 é expressa durante o estágio mielocítico de desenvolvimento de precursores de PMN (células polimorfonucleares) na medula óssea29 e é armazenado como enzima latente (pro-mmp-8) dentro dos grânulos específicos de PMN.30 A Pro-MMP-8 é rapidamente liberada do PMN ativado que sofre degranulação31 e, em seguida, é ativada por meio do mecanismo de troca de cisteína para produzir a forma ativa da enzima.29 A MMP-8 (colagenase polimorfonuclear5) cliva a hélice tripla do colágeno fibrilar e tem afinidade pelo tipo I colágeno e colágeno tipo III5 que é abundantemente encontrado no tecido conjuntivo da gengiva. A MMP-8 degrada a gelatina tipo VII, VIII e colágeno X.5 A MMP-8 foi considerada importante para a cicatrização de feridas agudas.6 A avaliação da progressão da cicatrização da ferida após a cirurgia é importante. Atualmente, marcadores substitutos contundentes, como sondagem, são usados. A limitação desses marcadores é que eles representam a história da cura e não a atividade em andamento. Como a marca da cicatrização é a remodelação do colágeno, é interessante estudar o perfil de citocinas relacionado à cicatrização de feridas. Tal conhecimento pode potencialmente levar a novas estratégias de diagnóstico para estudar a cicatrização de feridas de uma maneira melhor, refletindo o fenótipo de cicatrização.

A função da colagenase durante a cicatrização normal de feridas após cirurgia periodontal tem sido relativamente mal definida devido à falta de estudos nesta área.10 A maior parte da pesquisa concentrou-se na caracterização de MMP-8 durante a patogênese da doença periodontal8 e nas mudanças no nível de MMP-8 após o tratamento periodontal.

Nwomeh et al estudaram a MMP-8 da cicatrização de feridas dérmicas coletando o exsudato da ferida de uma bandagem oclusiva. Ele observou que a MMP-8 atingiu o pico no dia 4 e persistiu por cerca de uma semana. A superexpressão de MMP-8 leva a uma cicatrização defeituosa.5 As feridas crônicas têm MMPs 30 vezes maiores do que as feridas agudas. A inibição da expressão excessiva de protease nessas feridas pode permitir um tratamento prospectivo de cicatrização de feridas.5 Muito menos se sabe sobre os aspectos celulares da cicatrização dos tecidos moles na mucosa oral. A suposição de que a cicatrização oral é semelhante a feridas dérmicas pode provocar confusão, pois há certas diferenças sutis como formação de cicatriz reduzida nas feridas dérmicas2, papel da IL-1 em feridas orais e ausência de IL-1 em feridas dérmicas11, cicatrização mais rápida em feridas orais, presença de saliva que ajuda na cicatrização, etc. No geral, ainda é uma questão de especulação e ambigüidade sobre as diferenças no padrão único de cicatrização das feridas orais.

Compreender a cicatrização de feridas em nível molecular fornece uma base aprofundada para desenvolver estratégias de tratamento que podem prevenir a cicatrização retardada.2 Conforme recomendado pelo Relatório de Consenso do 10º workshop europeu de periodontologia de que há necessidade de mais estudos em nível celular para identificar citocinas, quimiocinas e redes de sinalização intracelular para melhores abordagens regenerativas10, o presente ensaio clínico foi desenhado.

Devido a uma lacuna considerável nesta área de pesquisa periodontal, este estudo está planejado para avaliar os níveis de MMP-8 durante a cicatrização pós-operatória após a cirurgia CAF+SCTG para cobertura de recessão e para melhor identificar o mecanismo envolvido na cicatrização de feridas. Esta informação pode ser usada para evitar que a ferida cirúrgica normal tenha uma experiência de cicatrização alterada.

6.2 REVISÃO DA LITERATURA: Sanctis et al. (2011) realizaram um estudo para determinar o uso de enxerto de tecido conjuntivo (CTG) no recobrimento radicular. Os resultados provaram que CAF em associação com SCTG é uma abordagem válida no tratamento de defeitos de recessão Nwomeh et al. (1999) avaliaram as fontes de colagenases (MMP-8, MMP-1) e sua atividade em feridas de cicatrização normal e úlceras crônicas que não cicatrizam. Os resultados mostraram que a MMP-8 é a colagenase predominante presente em feridas com cicatrização normal e úlceras crônicas que não cicatrizam tinham níveis aumentados de MMP-1,8 e níveis reduzidos de TIMP-1 Armstrong et al (2002) revisaram o papel fundamental da MMP-8 na cicatrização de feridas como colagenase predominante. Ele elaborou as expressões dos níveis máximos de MMP-8 nos dias 4 e 7 durante a cicatrização normal de feridas.

Hammerle et al (2014) em um relatório de consenso que revisou os processos biológicos de cicatrização de feridas de tecidos moles na cavidade oral, descobriu que a cicatrização de tecidos moles orais em dentes, implantes e rebordo edêntulo segue a mesma fase que a cicatrização de feridas na pele e os dados histológicos humanos são limitado.

Sorsa et al (2010) compararam quatro métodos para a detecção de metaloproteinase da matriz fluida gengival (MMP-8), ou seja, ensaio imunofluormétrico, teste de bastão, ensaio imunoblot dentoAnalyser e kit ELISA em seu estudo e concluiu que todos os ensaios são comparáveis ​​e o dentoAnalyser é entre os primeiros dispositivos quantitativos de teste lateral da cadeira MMP-8 em diagnósticos e pesquisas periodontais e peri-implantares.

Fernandez et al (2007) conduziram um estudo para investigar o papel da MMP_8 na cicatrização de feridas cutâneas. Eles observaram um atraso significativo no fechamento da ferida em camundongos MMP-8 -/- e uma resposta inflamatória alterada em suas feridas. Eles indicaram que a MMP-8 participa do reparo de feridas pela resolução da inflamação e abrem a possibilidade de desenvolver novas estratégias para o tratamento de defeitos de cicatrização de feridas.

Mohd H et al (1999)19 avaliaram os níveis de MMP-8 e MMP-3 durante a fase inicial de cicatrização após um procedimento de regeneração tecidual guiada avaliando amostras de GCF (Gingival Crevicular Fluid) para quantificação de MMP-8 e MMP-3. Eles descobriram que a presença da membrana parecia aumentar os níveis de MMP-3 e -8 e se relacionar com a reabsorção da membrana bioabsorvível pelos sistemas hospedeiros.

Dickinson et al (2013) estudaram os eventos iniciais na regeneração periodontal no modelo de defeito periodontal supraalveolar canino usando técnicas histológicas e imunológicas e concluíram que a ativação de eventos regenerativos celulares na regeneração da ferida periodontal é rápida, o quadro geral de formação de tecido (osso , ligamento periodontal e tecido conjuntivo) é amplamente delineado em 14 dias.

Shaw et al (2009) revisaram rapidamente o reparo de feridas e descreveram o complexo processo de reparo de feridas. Ele enfatizou que a remodelação da matriz extracelular é realizada por um delicado equilíbrio de MMPs.

Teles et al (2010) mediram os níveis de biomarcadores GCF e espécies bacterianas subgengivais em indivíduos periodontalmente saudáveis ​​e com periodontite. Ele concluiu que locais clinicamente saudáveis ​​de indivíduos com periodontite apresentam níveis mais altos de biomarcadores GCF e patógenos periodontais do que locais de indivíduos saudáveis.

6.3 Objetivo do estudo: O objetivo principal deste estudo é avaliar o efeito e o impacto de CAF+SCTG para recobrimento radicular em locais de recessão gengival classe I e II de Miller nos níveis de MMP-8 em GCF e soro.

O objetivo secundário é testar a utilidade do nível de MMP-8 da linha de base na previsão de resultados de tratamento avaliados categoricamente e correlacioná-lo com o padrão de cicatrização precoce de feridas após CAF+SCTG para cobertura radicular.

MATERIAIS E MÉTODOS:

7.1 Fonte dos dados:

Os pacientes que visitam o Departamento de Periodontia ambulatorial, Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital e satisfazem os critérios de inclusão e exclusão serão selecionados para o estudo.

O projeto experimental consistirá em um total de 15 a 20 locais que serão recrutados para o estudo de acordo com os critérios de inclusão e exclusão. Os pacientes serão informados sobre o procedimento cirúrgico e os materiais utilizados para o estudo e um consentimento informado será obtido dos pacientes.

7.2 Método de coleta de dados:

Tamanho da amostra:

Este estudo prospectivo será um estudo de controle clínico comparativo único cego com 15-20 pacientes com defeitos de recessão classe I e II de Miller no arco anterior superior.

técnica de amostragem

• Após os exames de triagem na fase inicial, cada sujeito receberá uma sessão de instruções de higiene oral, raspagem e alisamento radicular com raspadores ultrassônicos e curetas manuais.
• O tratamento cirúrgico do defeito de recessão não será agendado até que o paciente possa demonstrar um padrão adequado de controle de placa supragengival (escore de placa <20% O Leary 1972). Os parâmetros clínicos abaixo mencionados serão registrados ao milímetro mais próximo usando uma sonda UNC-15 (University of North Carolina -15 periodontal probe -Hu Friedy, Chicago, IL, EUA) e stents oclusais de medição para posicionamento de sondas de medição serão fabricados com resina acrílica curada a frio sobre um modelo fundido obtido a partir de uma impressão de alginato. Será construído de forma a cobrir as superfícies oclusais do dente a ser tratado e as superfícies oclusais de pelo menos um dente nas direções mesial e distal. Ele também será estendido apicalmente nas superfícies vestibular e lingual para cobrir o terço coronal dos dentes. Três ranhuras serão marcadas no stent nos locais mésio-vestibular, médio-vestibular e disto-vestibular como pontos de referência15 para que a medição pós-cirúrgica seja feita na mesma posição e angulação daquelas feitas antes da cirurgia, ou seja, medições de linha de base depois 6 meses.
• A amostra GCF será coletada do sulco gengival do dente indicado para procedimento de recobrimento radicular (controle negativo) e de outro dente com gengiva clinicamente saudável (controle positivo). As amostras serão coletadas no início e no acompanhamento pós-cirúrgico subsequente (quarto dia, sétimo dia e 6 meses).

Medições clínicas:

A seguinte medição clínica será registrada na linha de base e após 6 meses.

1. Profundidade da recessão gengival (GRD), medida como a distância entre a JCE e a margem gengival.17
2. Largura da Recessão Gengival (GRW), medida como a distância entre a margem gengival mesial e a margem gengival distal.17
3. Profundidade de Sondagem (PD), medida como a distância da margem gengival até a base do sulco gengival.17
4. Nível de Fixação Clínica (CAL), medida da JCE (junção amelocementária) até a base do sulco gengival.17
5. Largura apico coronal do tecido queratinizado (KTW) medida como a distância da junção mucogengival até a margem gengival.17
6. Os índices de cicatrização de feridas (WHI) serão avaliados no 4º e 7º dia (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Índice de placa (Sillness e Loe, 1964)
8. Índice gengival (Loe e Sillness, 1963)
9. Índice de sangramento gengival (Ainamo e Bay, 1975)

PROCEDIMENTO CIRÚRGICO:

• Antes de iniciar a cirurgia, as superfícies radiculares próximas à perda de inserção vestibular serão instrumentadas com mini-cinco Gracey Currettes e o tratamento mecânico será encerrado quando as superfícies radiculares lisas e duras forem obtidas.16
• Sob anestesia local, cloridrato de lignocaína a 2% (Ligox 2%, Indoco Remedies Ltd, Goa, Índia) usando uma lâmina nº 15 BP (Bard Parker), uma incisão submarginal será feita na face vestibular do dente tratado e estendida 3 mm horizontalmente na gengiva interdental mesial e distal. Uma incisão intrasulcular será feita na face vestibular do dente envolvido. Duas incisões oblíquas e divergentes serão seguidas, estendendo-se além da junção mucogengival.
• Um retalho de espessura total será elevado até a JMG (junção mucogengival) usando um pequeno elevador periosteal. Posteriormente, um retalho de espessura parcial será levantado além da junção mucogengival para permitir um deslocamento coronal passivo do retalho cobrindo completamente a junção amelocementária sem tensão.16
• O alisamento radicular será feito usando uma cureta afiada. As papilas adjacentes ao dente tratado serão desepitelizadas para criar uma superfície de sangramento para um leito receptor, onde o SCTG será colocado.
• O local doador consistindo de enxerto de tecido conjuntivo palatino de 2 mm de espessura será colhido da área do pré-molar ao primeiro molar usando a técnica de 'alçapão'.14 O enxerto de tecido conjuntivo será fixado na posição com suturas absorvíveis 4-0 nos locais receptores.
• Os retalhos serão estabilizados com sutura tipo sling em posição coronal, seguida de sutura interrompida ao liberar as incisões no sentido apico-coronal com fio absorvível 4-0.14
• Os sítios cirúrgicos serão protegidos com curativo periodontal sem eugenol. As instruções pós-operatórias consistirão em enxaguatório bucal com clorexidina 0,2% 3 vezes ao dia por 3 semanas e ibuprofeno 600 mg para controle da dor por três dias. 33
• As suturas serão removidas 7 dias após a cirurgia e após isso os pacientes serão reinstruídos na limpeza mecânica dos dentes tratados com o uso de escova de dentes macia.33
• A recordação e o reforço das instruções de higiene oral serão feitos a cada 2 meses.

Amostragem de fluido crevicular gengival (GCF) e ELISA:

• Os sujeitos ficarão sentados confortavelmente em posição ereta na cadeira odontológica, e o local selecionado estará bem iluminado.
• Amostras GCF serão coletadas após o índice de placa, mas antes de quaisquer outros registros clínicos que possam causar irritação tecidual e contaminação sanguínea da amostra.19 Durante o 4º e 7º dia de acompanhamento pós-operatório, o curativo periodontal será removido suavemente e amostras GCF serão coletadas do sulco gengival.
• Depois de secar suavemente a área com um jato de ar, a placa supragengival será removida sem tocar na gengiva marginal. A área será isolada com rolos de algodão para evitar a contaminação por saliva e GCF será coletado inserindo tiras de papel padrão (papel perio; oraflow Inc., Smithtown, NY, EUA) na fenda até sentir resistência leve por 30 segundos.19
• O volume da amostra GCF será medido em um aparelho calibrado (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, EUA)TM, após o qual as leituras serão convertidas para um volume real (µl) por referência à curva padrão. As tiras do local selecionado serão transferidas para tubos microcentrifugados contendo 200(µl) de tampão fosfato salino.19

Amostragem de soro:

• Oito mililitros (8 ml) de sangue serão coletados da fossa antecubital após jejum de 12 horas pela manhã com agulha calibre 20 com seringas de 2 ml e serão imediatamente encaminhados ao laboratório.
• A amostra de sangue será deixada coagular em temperatura ambiente por uma hora, o soro será extraído do sangue por centrifugação a 3000 rpm por 15 minutos. A amostra de soro será imediatamente transferida para frasco plástico e armazenada a -800C até o momento do ensaio34 realizado com o kit Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).

Resultado:

O resultado primário medido será:

• Níveis de MMP-8 em GCF e soro no início do estudo e subsequente acompanhamento pós-operatório após procedimento CAF+SCTG (4º, 7º e 6º mês).
• Análise quantitativa de amostras GCF no início e 4º, 7º e 6º meses de acompanhamento pós-cirúrgico.
• Correlação dos valores séricos de GCF e MMP-8 no início do estudo e 4º, 7º e 6º meses de acompanhamento pós-operatório.

O resultado secundário medido será:

1. Os índices de cicatrização de feridas (WHI) serão avaliados no 4º e 7º dia
2. Profundidade da recessão gengival (GRD)
3. Largura da Recessão Gengival (GRW)
4. Profundidade de Sondagem (PD)
5. Nível de Apego Clínico (CAL)
6. Largura apico coronal do tecido queratinizado (KTW)
7. Índice de Placa, Índice Gengival e Índice de Sangramento Gengival

Todos os parâmetros acima serão correlacionados com os níveis de MMP-8.

Análise estatística

Os valores obtidos serão comparados entre o GCF e o soro por meio do teste ANOVA. Diferenças médias em intervalos de tempo diferentes do valor da linha de base serão testadas usando o teste Mann-Whitney U separadamente. Um valor de 'p' < 0,05 será considerado estatisticamente significativo.