Az MMP-8 szintjének becslése a GCF-ben és a szérumban, valamint összefüggése a sebgyógyulással és a klinikai eredményekkel koronálisan előrehaladott lebeny és szubepitheliális kötőszöveti graft után a gyökérfedésre recessziós defektusok esetén: KLINIKAI-BIOKÉMIAI VIZSGÁLAT

A TANULMÁNY IGÉNYE:

A szubepiteliális kötőszövet-graft (CAF+SCTG) technikával ellátott koronálisan fejlett lebeny az egyik legsikeresebb gyökérfedési módnak bizonyult.1 Minden sebészeti beavatkozás sikere a sebgyógyulástól függ.

A sebészeti beavatkozás utáni sebgyógyulás összetett és erősen összehangolt esemény, amely magában foglalja a vérzéscsillapító fázist, a gyulladásos fázist, az új szövetképződés fázisát és a végső remodelling fázist, amely kollagénben gazdag extracelluláris mátrixot (ECM) és sűrű és stabil szövetet hagy maga után.2 A sebgyógyulás során a vérrög alapot ad a jövőbeli ECM-hez. Az ECM létfontosságú szerepet játszik a sejtmigráció, adhézió, a sebösszehúzódás és a hámképződés előidézésében. Az ECM-nek ezt a kulcsfontosságú szerepét az enzimek egy csoportja tartja fenn, amelyek együttesen Matrix Metalloproteinase-ként (MMP) ismertek. Az MMP-k központi szerepet játszanak a sebgyógyulásban.3,4 Ezen MMP-k szabályozásának kudarca összefügg a hibás sebgyógyulással.3,4 MMP-k (pl. a kollagenázok, zselatinázok, matrilizinek, stromelizinek és membrán típusú MMP-k) a cinkfüggő endopeptidázok családja, amelyek képesek az extracelluláris mátrix (ECM) hasítására gyógyuló sebekben. Az MMP-8-at elsősorban a neutrofilek termelik, és más sejtek, például szájhámsejtek, plazmasejtek és fibroblasztok is termelik.7 Az MMP-8 a PMN (polimorfonukleáris sejt) prekurzorok mielocitikus fejlődési szakaszában expresszálódik a csontvelőben29 és látens enzimként (pro-mmp-8) tárolódik a PMN specifikus granulátumaiban.30 A Pro-MMP-8 gyorsan felszabadul az aktivált PMN-ből, amely degranuláción megy keresztül31, majd a cisztein kapcsoló mechanizmuson keresztül aktiválódik, hogy az enzim aktív formáját adja.29 Az MMP-8 (polimorfonukleáris kollagenáz5) hasítja a fibrilláris kollagén hármas hélixét, és affinitást mutat az I. típusúhoz kollagén és III-as típusú kollagén5, amely bőségesen megtalálható a fogíny kötőszövetében. Az MMP-8 lebontja a VII, VIII és X típusú zselatin kollagént.5 Az MMP-8 fontos szerepet játszik az akut sebgyógyulásban.6 Fontos a sebgyógyulás előrehaladásának felmérése a műtét után. Jelenleg tompa helyettesítő markereket, például szondázást használnak. Ezeknek a markereknek az a korlátja, hogy a gyógyulás történetét képviselik, nem pedig a folyamatban lévő tevékenységet. Mivel a gyógyulás fémjelzi a kollagén átépülését, érdemes a sebgyógyulással kapcsolatos citokinprofilt tanulmányozni. Az ilyen ismeretek potenciálisan új diagnosztikai stratégiákhoz vezethetnek a sebgyógyulás jobb tanulmányozására, amely jobban tükrözi a gyógyulási fenotípust.

A kollagenáz funkciója a periodontális műtétek utáni normál sebgyógyulás során viszonylag rosszul definiált, mivel nem készültek erre a területre vonatkozó tanulmányok. A kutatások nagy része az MMP-8 jellemzésére irányult a parodontális betegség patogenezise során8 és az MMP-8 szint változásaira a parodontális kezelés után.

Nwomeh és munkatársai a dermális sebgyógyulásból származó MMP-8-at vizsgálták úgy, hogy összegyűjtötték a sebváladékot az okkluzív kötésből. Megjegyezte, hogy az MMP-8 a 4. napon érte el a csúcsát, és körülbelül egy hétig fennmaradt. Az MMP-8 túlzott expressziója hibás gyógyuláshoz vezet.5 A krónikus sebek MMP-je 30-szor nagyobb, mint az akut sebekben. A túlzott proteázexpresszió gátlása ezekben a sebekben lehetővé teheti egy prospektív sebgyógyulási kezelést.5 Nagyon keveset tudunk a szájnyálkahártyában a lágyrészek gyógyulásának sejtes vonatkozásairól. Az a feltételezés, hogy a szájüregi gyógyulás hasonló a dermális sebekhez, zavart kelthet, mivel vannak bizonyos finom különbségek, mint például csökkent hegképződés a bőrsebekben2, az IL-1 szerepe a szájsebekben és az IL-1 hiánya a bőrsebekben11, a gyorsabb gyógyulás szájsebek, nyál jelenléte, amely segíti a gyógyulást stb. Összességében még mindig csak találgatások és kétértelműségek kérdéses a szájsebek egyedi gyógyulási mintája közötti különbségek.

A sebgyógyulás molekuláris szintű megértése mélyreható alapot biztosít olyan kezelési stratégiák kidolgozásához, amelyek megakadályozzák a késleltetett gyógyulást.2 A 10. európai parodontológiai műhely konszenzusjelentése szerint, hogy több sejtszintű vizsgálatra van szükség a citokin, kemokin és intracelluláris jelátviteli hálózatok azonosítására a jobb regenerációs megközelítések érdekében10, a jelen klinikai vizsgálatot megtervezték.

A periodontális kutatás ezen területén tapasztalható jelentős hiányosságai miatt ez a tanulmány a tervek szerint az MMP-8 szintjét méri fel a CAF+SCTG műtétet követő műtét utáni gyógyulás során a recessziós lefedettség érdekében, és jobban azonosítja a sebgyógyulásban szerepet játszó mechanizmust. Ez az információ felhasználható arra, hogy megakadályozza a normál műtéti seb gyógyulási tapasztalatának megváltozását.

6.2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS: Sanctis et al. (2011) tanulmányt végzett a kötőszöveti graft (CTG) gyökérborításban való használatának meghatározására. Az eredmények bebizonyították, hogy a CAF SCTG-vel összekapcsolva érvényes megközelítés a recessziós defektusok kezelésében Nwomeh et al. (1999) a kollagenázok (MMP-8, MMP-1) forrásait és azok aktivitását vizsgálták normál gyógyuló sebekben és krónikus, nem gyógyuló fekélyekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az MMP-8 a domináns kollagenáz, amely jelen van a normál gyógyuló sebekben, és a krónikus, nem gyógyuló fekélyek MMP-1,8 szintje emelkedett, a TIMP-1 szintje pedig csökkent. Armstrong és munkatársai (2002) áttekintették az MMP-8 kulcsszerepét sebgyógyulás, mint a domináns kollagenáz. Kidolgozta az MMP-8 csúcsszintjének kifejeződését a 4. és 7. napon a normál sebgyógyulás során.

Hammerle és munkatársai (2014) egy konszenzusos jelentésben, amely a lágyrészek szájüregi sebgyógyulásának biológiai folyamatait vizsgálta, megállapította, hogy a száj lágyrészeinek gyógyulása a fogaknál, az implantátumoknál és a fogatlan gerincnél ugyanazt a fázist követi, mint a bőrsebgyógyulás, és a humán szövettani adatok is korlátozott.

Sorsa és munkatársai (2010) négy módszert hasonlítottak össze a gingivális résfolyadék mátrix metalloproteináz (MMP-8) kimutatására, azaz az immunfluorométeres tesztet, a Dip stick tesztet, a dentoAnalyser immunoblot assayt és az ELISA kit-et, és arra a következtetésre jutottak, hogy az összes teszt összehasonlítható és a dentoAnalyser az első kvantitatív MMP-8 székoldalt vizsgáló eszközök között a parodontális és periimplantátum diagnosztikában és kutatásban.

Fernandez és munkatársai (2007) tanulmányt végeztek az MMP_8 szerepének vizsgálatára a bőr sebgyógyulásában. Szignifikáns késést figyeltek meg a sebzáródásban MMP-8 -/- egerekben, és megváltozott gyulladásos választ a sebeikben. Kimutatták, hogy az MMP-8 a gyulladás megszüntetésével részt vesz a sebgyógyulásban, és lehetőséget teremt új stratégiák kidolgozására a sebgyógyulási rendellenességek kezelésére.

Mohd H és munkatársai (1999)19 az MMP-8 és az MMP-3 szintjét a korai gyógyulási szakaszban egy irányított szövetregenerációs eljárást követően GCF (Gingival Crevicular Fluid) minták értékelésével mérték fel az MMP-8 és MMP-3 mennyiségi meghatározására. Azt találták, hogy a membrán jelenléte úgy tűnik, hogy növeli az MMP-3 és -8 szintjét, és összefügg a bioreszorbeálódó membrán gazdarendszerek általi reszorpciójával.

Dickinson és mtsai (2013) szövettani és immunológiai technikák segítségével vizsgálták a periodontális regeneráció korai eseményeit a kutya supraalveoláris periodontális defektus modelljében, és arra a következtetésre jutottak, hogy a sejtregenerációs események aktiválódása a parodontális seb regenerációjában gyors, a szövetképződés általános kerete (csont). , periodontális ínszalag és Kötőszövet) 14 napon belül nagy vonalakban körvonalazódik.

Shaw és munkatársai (2009) egy pillantással áttekintették a sebgyógyulást, és leírták a sebjavítás összetett folyamatát. Hangsúlyozta, hogy az extracelluláris mátrix átalakulását az MMP-k finom egyensúlya valósítja meg.

Teles és munkatársai (2010) a GCF biomarkerek és a szubgingivális baktériumfajok szintjét mérték parodontálisan egészséges és parodontitiszes alanyokban. Arra a következtetésre jutott, hogy a parodontitiszes alanyok klinikailag egészséges helyein magasabb a GCF biomarkerek és a parodontális kórokozók szintje, mint az egészséges alanyokból származó helyeken.

6.3 A vizsgálat célja: Ennek a vizsgálatnak az elsődleges célja, hogy értékelje a CAF+SCTG hatását és hatását a Millers I. és II. osztályú gingivális recessziós helyeken a gyökérborításra a GCF és a szérum MMP-8 szintjére.

A másodlagos cél az alapvonali MMP-8 szint hasznosságának tesztelése a kategorikusan értékelt kezelési eredmények előrejelzésében, és összefüggésbe hozása a korai sebgyógyulási mintával a CAF+SCTG-t követve a gyökérfedésre.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK:

7.1 Az adatok forrása:

A Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital ambuláns Parodontológiai Osztályát meglátogató és a befogadási és kizárási kritériumoknak megfelelő betegeket kiszűrik és kiválasztják a vizsgálatba.

A kísérleti terv összesen 15-20 helyszínből fog állni, akiket a felvételi és kizárási kritériumok szerint toboroznak a vizsgálatba. A betegek tájékoztatást kapnak a műtéti eljárásról és a vizsgálathoz felhasznált anyagokról, valamint a betegek tájékozott beleegyezését kérik.

7.2 Az adatgyűjtés módja:

Minta nagysága:

Ez a prospektív vizsgálat egyetlen vak, összehasonlító klinikai kontroll vizsgálat lesz 15-20 olyan beteg bevonásával, akiknek Miller I. és II. osztályú recessziós defektusai vannak az elülső maxilláris ívben.

Mintavételi technika

• A kezdeti szakaszban végzett szűrővizsgálatok után minden alany kap egy foglalkozást a szájhigiénés instrukciókról, a hámlásról és a gyökértervezésről ultrahangos pikkelyezőkkel és kézi küretekkel.
• A recessziós defektus sebészi kezelését addig nem tervezik, amíg a páciens nem tudja igazolni a szupragingivális plakk kontroll megfelelő színvonalát (a plakk pontszám <20% O Leary 1972). Az alább említett klinikai paramétereket UNC-15 szondával (University of North Carolina -15 periodontális szonda - Hu Friedy, Chicago, IL, USA) milliméteres pontossággal rögzítik, és a mérőszondák pozicionálásához mérő okkluzális stenteket készítenek hidegen keményített akrilgyanta öntött modellen, amelyet alginát lenyomatból nyernek. Úgy kell kialakítani, hogy meziális és disztális irányban lefedje a kezelt fog okklúziós felületeit és legalább egy fog okklúziós felületét. A bukkális és linguális felületeken is apikálisan meghosszabbodik, hogy lefedje a fogak koronális harmadát. A stenten három barázda lesz megjelölve a mesio-bukkális, a bukkális középső és a diszto-bukkális helyeken referenciapontként15, így a műtét utáni mérés ugyanabban a pozícióban és szögben történik, mint a műtét előtt, azaz a kiindulási mérések, majd 6 után. hónapok.
• A GCF mintát a gyökérfedő eljárásra javasolt fog ínysulcusából (negatív kontroll) és egy másik, klinikailag egészséges fogínyű fogból (pozitív kontroll) veszik. A mintákat a kiinduláskor és a műtét utáni követéskor (negyedik nap, hetedik nap és 6 hónap) veszik.

Klinikai mérések:

A következő klinikai mérést a kiinduláskor és 6 hónap elteltével rögzítik.

1. Gingival Recessziós mélység (GRD), a CEJ és a fogíny széle közötti távolságként mérve.17
2. Gingival Recession Width (GRW), a mesiális gingiva margin és a disztális gingiva margin közötti távolságként mérve.17
3. A szondázási mélység (PD), a fogíny szélétől a gingivális barázda tövéig mért távolságként.17
4. Clinical Attachment Level (CAL), mérés a CEJ-től (cementozománc junction) a gingiva sulcus aljáig.17
5. A keratinizált szövet apico coronalis szélessége (KTW) a mucogingivális csomópont és az ínyszél távolságaként mérve.17
6. A sebgyógyulási indexeket (WHI) a 4. és 7. napon értékelik (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Plaque Index (Sillness and Loe, 1964)
8. Gingiva Index (Loe és Sillness, 1963)
9. Fogínyvérzési index (Ainamo és Bay, 1975)

MŰTÉTI ELJÁRÁS:

• A műtét megkezdése előtt a bukkális kötődés elvesztéséhez közeli gyökérfelületeket mini-öt Gracey Currette-vel műszerezzük, és a mechanikai kezelést akkor fejezzük be, ha sima és kemény gyökérfelszínt kapunk.16
• Helyi érzéstelenítésben, 2%-os lignokain-hidrokloridban (Ligox 2%, Indoco Remedies Ltd, Goa, India) No. 15 BP (Bard Parker) pengével, szubmarginális metszést végeznek a kezelt fog bukkális részén, és 3 mm-re meghosszabbítják. vízszintesen a mesiális és distalis interdentalis gingivában. Az érintett fog bukkális részén intrasulcularis bemetszést végeznek. Két ferde, egymástól eltérő elengedő bemetszést követünk, amelyek túlnyúlnak a mucogingivális csomóponton.
• A teljes vastagságú szárny az MGJ-ig (mucogingival junction) megemelkedik egy kis periostealis lift segítségével. Ezt követően egy részleges vastagságú lebeny megemelkedik a mucogingivális csomóponton túl, hogy lehetővé tegye a szárny passzív koronális elmozdulását, amely feszültség nélkül teljesen lefedi a CEJ-t.16
• A gyökértervezés éles küret segítségével történik. A kezelt fog melletti papillákat epitelializálják, hogy vérző felületet hozzon létre a recipiens ágy számára, ahová az SCTG-t helyezik.
• A 2 mm vastag palatális kötőszövet graftból álló donor helyet a premoláristól az első moláris területig gyűjtik be a „csapóajtó” technikával.14 A kötőszöveti graftot 4-0 felszívódó varrattal rögzítik a recipiens helyeken.
• A szárnyakat hevedervarrattal stabilizáljuk koronális pozícióban, majd megszakított varratokat a felszabaduló bemetszések során apico-coronalis irányban 4-0 felszívódó varrat segítségével.14
• A műtéti helyeket nem eugenol periodontális kötéssel védjük. A műtét utáni utasítások a következőkből állnak: 0,2%-os klórhexidin szájöblítés naponta háromszor 3 héten keresztül, valamint 600 mg ibuprofén a fájdalomcsillapításra három napon keresztül. 33
• A műtét után 7 nappal eltávolítják a varratokat, majd ezt követően a betegeket a kezelt fogak mechanikai tisztítására, puha fogkefével újra be kell tanítani.33
• A szájhigiénés utasítások visszahívása és megerősítése 2 havonta történik.

Gingival crevicularis folyadék (GCF) mintavétel és ELISA:

• Az alanyok kényelmesen, függőleges helyzetben ülnek a fogorvosi széken, és a kiválasztott hely jól megvilágított.
• A GCF-mintákat a plakk index után kell gyűjteni, de minden olyan klinikai felvétel előtt, amely szöveti irritációt és a minta vérszennyeződését okozhatja.19 A műtétet követő 4. és 7. napon a periodontális kötést óvatosan eltávolítják, és a GCF mintákat gyűjtik a gingiva sulcusból.
• A terület finom légfúvásos szárítása után a szupragingivális plakk eltávolításra kerül anélkül, hogy megérintené a marginális ínyet. A területet pamuttekercsekkel izolálják, hogy megakadályozzák a nyállal való szennyeződést, és a GCF-et összegyűjtik szabványos papírcsíkok (perio paper; oraflow Inc., Smithtown, NY, USA) behelyezésével a résbe, amíg enyhe ellenállást nem érez 30 másodpercig.19
• A GCF minta térfogatát kalibrált készülékben (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM mérik, majd a leolvasott értékeket tényleges térfogatra (µl) konvertálják a standard görbe alapján. A kiválasztott helyről származó csíkokat 200 (µl) foszfátpuffer sóoldatot tartalmazó mikrocentrifugált csövekbe visszük át.19

Szérum mintavétel:

• Nyolc milliliter (8 ml) vért veszünk az antecubitalis üregből reggel 12 órás koplalás után 20-as méretű tűvel, 2 ml-es fecskendőkkel, és azonnal átvisszük a laboratóriumba.
• A vérmintát szobahőmérsékleten egy órán keresztül hagyjuk megalvadni, majd a szérumot 3000 fordulat/perc sebességgel, 15 percig tartó centrifugálással vonják ki a vérből. A szérummintát azonnal átvisszük egy műanyag fiolába, és -80 °C-on tároljuk az Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) készlettel végzett vizsgálatig34.

Eredmény:

Az elsődleges mért eredmény a következő lesz:

• MMP-8 szint a GCF-ben és a szérumban a kiinduláskor, majd a műtét utáni követés a CAF+SCTG eljárás után (4., 7. és 6. hónap).
• A GCF-minták kvantitatív elemzése a kiinduláskor és a műtét utáni 4., 7. és 6. hónapban.
• A GCF és a szérum MMP-8 értékek korrelációja a kiinduláskor és a műtét utáni 4., 7. és 6. hónapban.

A mért másodlagos eredmény a következő lesz:

1. A sebgyógyulási indexeket (WHI) a 4. és 7. napon értékeljük
2. Gingival recessziós mélység (GRD)
3. Gingival Recession Width (GRW)
4. Tapintási mélység (PD)
5. Klinikai kötődési szint (CAL)
6. Keratinizált szövet koronális szélessége (KTW)
7. Plaque Index, Gingival Index és Gingival Bleeding Index

A fenti paraméterek mindegyike korrelál az MMP-8 szintekkel.

Statisztikai analízis

A kapott értékeket ANOVA teszt segítségével hasonlítják össze a GCF és a szérum között. Az alapértéktől eltérő időintervallumokban tapasztalható átlagos eltéréseket a Mann-Whitney U teszttel külön teszteljük. A 0,05-nél kisebb „p” érték statisztikailag szignifikánsnak minősül.