Оценка уровней MMP-8 в GCF и сыворотке и их корреляция с заживлением ран и клиническими исходами после коронарно-продвинутого лоскута и субэпителиального трансплантата соединительной ткани для покрытия корня при рецессионных дефектах: КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

НЕОБХОДИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Коронально выдвинутый лоскут с субэпителиальным трансплантатом соединительной ткани (CAF+SCTG) оказался одним из наиболее успешных методов закрытия корня.1 Успех любой хирургической процедуры зависит от заживления раны.

Заживление раны после хирургического вмешательства представляет собой сложное и четко организованное событие, которое включает фазу гемостаза, фазу воспаления, фазу образования новой ткани и фазу окончательного ремоделирования, оставляя после себя богатый коллагеном внеклеточный матрикс (ECM) и плотную и стабильную ткань.2 Во время заживления ран сгусток обеспечивает основу для будущего ВКМ. ECM играет жизненно важную роль в ускорении клеточной миграции, адгезии, сокращении раны и эпителизации. Эта решающая роль ECM поддерживается группой ферментов, известных под общим названием матриксные металлопротеиназы (MMP). ММП играют центральную роль в заживлении ран.3,4 Нарушение регуляции этих MMP коррелирует с неправильным заживлением ран.3,4 MMP (т.е. коллагеназы, желатиназы, матрилизины, стромелизины и ММП мембранного типа) представляют собой семейство цинкзависимых эндопептидаз, способных расщеплять внеклеточный матрикс (ВКМ) при заживлении ран.3 ММП-8 в основном продуцируются нейтрофилами, а также другими клетками, такими как клетки эпителия полости рта, плазматические клетки и фибробласты. хранится в виде латентного фермента (pro-mmp-8) в специфических гранулах PMN.30 Pro-MMP-8 быстро высвобождается из активированных PMN, подвергающихся дегрануляции31, а затем активируется с помощью механизма переключения цистеина с образованием активной формы фермента29. MMP-8 (полиморфноядерная коллагеназа5) расщепляет тройную спираль фибриллярного коллагена и имеет сродство к типу I. коллагена и коллагена III типа5, который в изобилии содержится в соединительной ткани десны. ММП-8 расщепляет желатин, коллаген типов VII, VIII и X.5 Предполагается, что MMP-8 играет важную роль в заживлении острых ран.6 Оценка прогрессирования заживления раны после операции важна. В настоящее время используются тупые суррогатные маркеры, такие как зондирование. Ограничение этих маркеров заключается в том, что они представляют собой историю заживления, а не текущую активность. Поскольку отличительной чертой заживления является ремоделирование коллагена, представляет интерес изучение профиля цитокинов, связанного с заживлением ран. Такие знания потенциально могут привести к новым диагностическим стратегиям для изучения заживления ран, которые лучше отражают фенотип заживления.

Функция коллагеназы во время нормального заживления ран после операций на пародонте была относительно плохо определена из-за отсутствия исследований в этой области.10 Большая часть исследований была сосредоточена на характеристике MMP-8 в патогенезе пародонтита8 и изменениях уровня MMP-8 после пародонтологического лечения.

Nwomeh и соавт. изучали MMP-8 при заживлении кожных ран путем сбора раневого экссудата из окклюзионной повязки. Он отметил, что пик ММР-8 достигался на 4-й день и сохранялся в течение примерно недели. Чрезмерная экспрессия ММР-8 приводит к неправильному заживлению.5 Хронические раны содержат в 30 раз больше ММР, чем острые раны. Подавление избыточной экспрессии протеазы в этих ранах может способствовать перспективному лечению ран.5 Очень мало известно о клеточных аспектах заживления мягких тканей слизистой оболочки полости рта. Предположение о том, что заживление в ротовой полости похоже на кожные раны, может спровоцировать путаницу, поскольку существуют определенные тонкие различия, такие как меньшее образование рубцов в кожных ранах2, роль ИЛ-1 в ранах в ротовой полости и отсутствие ИЛ-1 в кожных ранах11, более быстрое заживление в раны в полости рта, наличие слюны, которая способствует заживлению и т. д. В целом, вопрос о различиях в уникальном характере заживления ран в полости рта по-прежнему остается предметом спекуляций и неясностей.

Понимание заживления ран на молекулярном уровне обеспечивает глубокую основу для разработки стратегий лечения, которые могут предотвратить замедленное заживление.2 В соответствии с рекомендацией консенсусного отчета 10-го европейского семинара по пародонтологии о необходимости проведения дополнительных исследований на клеточном уровне для выявления цитокинов, хемокинов и внутриклеточных сигнальных сетей для улучшения регенеративных подходов10, настоящее клиническое исследование было разработано.

Из-за значительных пробелов в этой области исследований пародонта это исследование планируется для оценки уровней MMP-8 во время послеоперационного заживления после операции CAF + SCTG для закрытия рецессии и для лучшего определения механизма, участвующего в заживлении раны. Эта информация может быть использована для предотвращения изменения процесса заживления нормальной хирургической раны.

6.2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Sanctis et al. (2011) провели исследование, чтобы определить использование соединительнотканного трансплантата (СТГ) для закрытия корня. Результаты доказали, что CAF в сочетании с SCTG является допустимым подходом к лечению дефектов рецессии Nwomeh et al. (1999) оценивали источники коллагеназ (ММР-8, ММР-1) и их активность в нормально заживающих ранах и хронических незаживающих язвах. Результаты показали, что MMP-8 является преобладающей коллагеназой, присутствующей в нормально заживающих ранах, а хронические незаживающие язвы имеют повышенный уровень MMP-1,8 и пониженный уровень TIMP-1. Армстронг и др. (2002) рассмотрели ключевую роль MMP-8 в заживление ран как преобладающая коллагеназа. Он разработал выражения пиковых уровней MMP-8 на 4-й и 7-й день во время нормального заживления ран.

Hammerle et al (2014) в консенсусном отчете, в котором рассматривались биологические процессы заживления ран мягких тканей в полости рта, обнаружили, что заживление мягких тканей полости рта на зубах, имплантатах и ​​беззубом гребне происходит в той же фазе, что и заживление кожных ран, а гистологические данные человека ограниченное.

Sorsa et al (2010) сравнили четыре метода определения металлопротеиназы матрикса жидкости десневой борозды (MMP-8), т. е. иммунофлуорометрический анализ, тест с помощью полоски-индикатора, иммуноблот-анализ dentoAnalyser и набор ELISA в своем исследовании, и пришли к выводу, что все анализы сопоставимы, а dentoAnalyser одно из первых устройств для количественного тестирования MMP-8 на стуле в диагностике и исследованиях пародонта и периимплантата.

Fernandez et al (2007) провели исследование, чтобы изучить роль MMP_8 в заживлении кожных ран. Они наблюдали значительную задержку закрытия ран у мышей MMP-8 -/- и измененную воспалительную реакцию в их ранах. Они указали, что MMP-8 участвует в заживлении ран путем устранения воспаления и открывает возможность разработки новых стратегий лечения дефектов заживления ран.

Mohd H et al (1999)19 оценили уровни ММР-8 и ММР-3 на ранней стадии заживления после процедуры направленной регенерации тканей путем оценки образцов GCF (жидкости десневой борозды) для количественного определения ММР-8 и ММР-3. Они обнаружили, что присутствие мембраны увеличивает уровни MMP-3 и -8 и связано с резорбцией биорезорбируемой мембраны системами хозяина.

Dickinson et al (2013) изучали ранние процессы регенерации периодонта на модели супраальвеолярного пародонтального дефекта у собак с использованием гистологических и иммунологических методов и пришли к выводу, что активация клеточных регенеративных процессов при регенерации пародонтальной раны происходит быстро, общая структура формирования ткани (костная , периодонтальная связка и соединительная ткань) в общих чертах определяется в течение 14 дней.

Shaw et al (2009) кратко рассмотрели заживление ран и описали сложный процесс заживления ран. Он подчеркнул, что ремоделирование внеклеточного матрикса осуществляется за счет тонкого баланса ММП.

Teles et al (2010) измерили уровни биомаркеров GCF и видов поддесневых бактерий у здоровых пародонтологов и пациентов с пародонтитом. Он пришел к выводу, что клинически здоровые участки у пациентов с пародонтитом имеют более высокие уровни биомаркеров GCF и пародонтальных патогенов, чем участки у здоровых людей.

6.3 Цель исследования. Основная цель данного исследования состоит в том, чтобы оценить эффект и воздействие CAF+SCTG на покрытие корней в местах рецессии десны I и II классов по Миллеру на уровни ММР-8 в GCF и сыворотке.

Вторичная цель состоит в том, чтобы проверить полезность базового уровня ММР-8 для прогнозирования категориально оцененных результатов лечения и соотнести его с характером раннего заживления раны после CAF+SCTG для закрытия корней.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

7.1 Источник данных:

Пациенты, посещающие амбулаторное отделение пародонтологии Колледжа стоматологических наук и больницы Кришнадеварая и удовлетворяющие критериям включения и исключения, будут проверены и отобраны для исследования.

Экспериментальный план будет состоять из 15-20 сайтов, которые будут набраны для исследования в соответствии с критериями включения и исключения. Пациенты будут проинформированы о хирургической процедуре и материалах, использованных для исследования, и от пациентов будет получено информированное согласие.

7.2 Метод сбора данных:

Размер образца:

Это проспективное исследование будет единственным слепым сравнительным клиническим контролем с участием 15-20 пациентов с рецессией I и II класса по Миллеру в переднем отделе верхней челюсти.

Техника отбора проб

• После скрининговых обследований на начальном этапе каждый субъект получит инструкции по гигиене полости рта, скейлингу и планированию корней с помощью ультразвуковых скейлеров и ручных кюреток.
• Хирургическое лечение дефекта рецессии не будет назначено до тех пор, пока пациент не продемонстрирует адекватный стандарт контроля наддесневого зубного налета (оценка зубного налета <20% O Leary 1972). Упомянутые ниже клинические параметры будут зарегистрированы с точностью до миллиметра с помощью зонда UNC-15 (Пародонтальный зонд Университета Северной Каролины -15 - Ху Фриди, Чикаго, Иллинойс, США), и будут изготовлены измерительные окклюзионные стенты для позиционирования измерительных зондов. акриловая смола холодного отверждения на литой модели, полученной с альгинатного оттиска. Он будет сконструирован таким образом, чтобы покрывать окклюзионные поверхности обрабатываемого зуба и окклюзионные поверхности по крайней мере одного зуба в мезиальном и дистальном направлениях. Он также будет расширен апикально на щечной и язычной поверхностях, чтобы покрыть коронковую треть зубов. Три канавки будут отмечены на стенте в мезио-щечном, средне-щечном и дистально-щечном участках в качестве контрольных точек15, чтобы послеоперационные измерения проводились в том же положении и с тем же углом, что и до операции, т. е. исходные измерения, а затем через 6 месяцы.
• Образец GCF будет взят из десневой борозды зуба, которому назначена процедура закрытия корня (отрицательный контроль), и из другого зуба с клинически здоровой десной (положительный контроль). Образцы будут собираться на исходном уровне и при последующем послеоперационном наблюдении (четвертый день, седьмой день и 6 месяцев).

Клинические измерения:

Следующие клинические измерения будут зарегистрированы на исходном уровне и через 6 месяцев.

1. Глубина рецессии десны (GRD), измеряемая как расстояние между CEJ и десневым краем.17
2. Ширина рецессии десны (GRW), измеренная как расстояние между мезиальным краем десны и дистальным краем десны.17
3. Глубина зондирования (PD), измеряемая как расстояние от края десны до основания десневой борозды.17
4. Клинический уровень прикрепления (CAL), измерение от CEJ (цементо-эмалевого соединения) до основания десневой борозды.17
5. Верхушечная ширина ороговевшей ткани (KTW) измеряется как расстояние от слизисто-десневого соединения до десневого края.17
6. Индексы заживления ран (WHI) будут оцениваться на 4-й и 7-й день (Lien-Hui Huang, 2005).
7. Индекс налета (Sillness and Loe, 1964)
8. Десневой индекс (Loe and Sillness, 1963)
9. Индекс кровоточивости десен (Айнамо и Бэй, 1975 г.)

ХИРУРГИЧЕСКАЯ ПРОЦЕДУРА:

• Перед началом операции поверхности корней рядом с щечной потерей прикрепления будут обрабатываться мини-пять Gracey Currettes, и механическое лечение будет прекращено, когда будут получены гладкие и твердые поверхности корней.16
• Под местной анестезией 2% гидрохлоридом лигнокаина (Ligox 2%, Indoco Remedies Ltd, Гоа, Индия) с использованием лезвия № 15 BP (Bard Parker) делается субмаргинальный разрез со щечной стороны обработанного зуба и расширяется на 3 мм. горизонтально в мезиальной и дистальной межзубной десне. Внутрибороздковый разрез будет сделан на щечной стороне пораженного зуба. Последуют два косых расходящихся послабляющих разреза, выходящих за пределы слизисто-десневого соединения.
• Полнослойный лоскут будет поднят до MGJ (слизисто-десневого соединения) с помощью небольшого надкостничного элеватора. Впоследствии частично утолщенный лоскут будет поднят за пределы слизисто-десневого соединения, чтобы обеспечить пассивное коронарное смещение лоскута, полностью закрывающее ЦЭГ без натяжения.16
• Планирование корней будет выполнено с помощью острой кюретки. Сосочки, прилегающие к леченому зубу, будут деэпителизированы, чтобы создать кровоточащую поверхность для реципиентного ложа, куда будет помещен ССТГ.
• Донорский участок, состоящий из трансплантата небной соединительной ткани толщиной 2 мм, будет взят от премоляра до области первого моляра с использованием техники «люка».14 Соединительнотканный трансплантат закрепляют рассасывающимися швами 4-0 в местах реципиента.
• Лоскуты будут стабилизированы петлевым швом в коронарном положении с последующим наложением узловых швов при освобождении разрезов в апико-корональном направлении с использованием рассасывающихся швов 4-0.14
• Хирургические участки будут защищены пародонтальной повязкой без эвгенола. Послеоперационные инструкции будут состоять из ополаскивания рта 0,2% хлоргексидином 3 раза в день в течение 3 недель и ибупрофена 600 мг для обезболивания в течение трех дней. 33
• Швы будут сняты через 7 дней после операции, после чего пациенты будут повторно обучены механической чистке леченых зубов с использованием мягкой зубной щетки.33
• Отзыв и подкрепление инструкций по гигиене полости рта будут проводиться каждые 2 месяца.

Забор жидкости десневой борозды (GCF) и ИФА:

• Субъекты будут удобно сидеть в вертикальном положении на стоматологическом кресле, а выбранный участок будет хорошо освещен.
• Образцы GCF будут собираться после индексации бляшек, но до любых других клинических записей, которые могут вызвать раздражение тканей и загрязнение образца кровью.19 В течение 4-го и 7-го дня послеоперационного наблюдения пародонтальная повязка будет осторожно удалена, а образцы GCF будут взяты из десневой борозды.
• После осторожного высушивания области струей воздуха наддесневой налет будет удален, не касаясь маргинальной десны. Область будет изолирована ватными тампонами, чтобы предотвратить загрязнение слюной, а GCF будет собираться путем вставки стандартных бумажных полосок (периодическая бумага; oraflow Inc., Смиттаун, штат Нью-Йорк, США) в расщелину до тех пор, пока не почувствуется легкое сопротивление в течение 30 секунд.19
• Объем образца GCF будет измеряться на калиброванном приборе (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM, после чего показания будут преобразованы в фактический объем (мкл) по стандартной кривой. Полоски из выбранного участка будут перенесены в микроцентрифужные пробирки, содержащие 200 (мкл) фосфатно-солевого буфера.19

Забор сыворотки:

• Восемь миллилитров (8 мл) крови будут взяты из локтевой ямки после 12-часового голодания утром с использованием иглы 20 размера и шприцев на 2 мл и будут немедленно переданы в лабораторию.
• Образцу крови дают свернуться при комнатной температуре в течение одного часа, сыворотку извлекают из крови путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 минут. Образец сыворотки немедленно переносят в пластиковый флакон и хранят при температуре -80°C до момента проведения анализа34 с использованием набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Исход:

Измеряемым первичным результатом будет:

• Уровни MMP-8 в GCF и сыворотке на исходном уровне и последующее послеоперационное наблюдение после процедуры CAF + SCTG (4-й, 7-й и 6-й месяцы).
• Количественный анализ образцов GCF на исходном уровне и через 4, 7 и 6 месяцев после операции.
• Корреляция значений GCF и MMP-8 в сыворотке на исходном уровне и через 4, 7 и 6 месяцев после операции.

Измеряемым вторичным результатом будет:

1. Индексы заживления ран (WHI) будут оцениваться на 4-й и 7-й день.
2. Глубина рецессии десны (GRD)
3. Ширина рецессии десны (GRW)
4. Глубина зондирования (PD)
5. Уровень клинической привязанности (CAL)
6. Верхушечная ширина ороговевшей ткани (KTW)
7. Индекс зубного налета, индекс десен и индекс кровоточивости десен

Все вышеперечисленные параметры будут коррелировать с уровнями MMP-8.

статистический анализ

Полученные значения будут сравниваться между GCF и сывороткой с использованием теста ANOVA. Средние различия в разные промежутки времени от исходного значения будут тестироваться с использованием U-критерия Манна-Уитни отдельно. Значение «p» <0,05 будет считаться статистически значимым.