Uppskattning av MMP-8-nivåer i GCF och serum och dess korrelation med sårläkning och kliniska resultat efter coronally Advanced Flap och subepitelial bindvävstransplantat för rottäckning vid recessionsdefekter: EN KLINIKO-BIOKEMISK STUDIE

BEHOV AV STUDIEN:

Coronalt avancerad flik med subepitelial bindvävsgraft (CAF+SCTG) teknik har visat sig vara en av de mest framgångsrika metoderna för rottäckning.1 Framgången för alla kirurgiska ingrepp är beroende av sårläkning.

Sårläkning efter kirurgisk ingrepp är en komplex och mycket orkestrerad händelse som inkluderar hemostatisk fas, inflammatorisk fas, fas av ny vävnadsbildning och den sista remodelleringsfasen som lämnar efter sig kollagenrik extracellulär matris (ECM) och en tät och stabil vävnad.2 Under sårläkning ger koagel en grund för framtida ECM. ECM spelar en viktig roll för att förmå cellmigration, vidhäftning, sårkontraktion och epitelisering. Denna avgörande roll för ECM upprätthålls av en grupp enzymer som gemensamt kallas Matrix Metalloproteinases (MMPs). MMP spelar en central roll vid sårläkning.3,4 Fel i regleringen av dessa MMP har korrelerats med felaktig sårläkning.3,4 MMPs (dvs. kollagenaser, gelatinaser, matrilysiner, stromelysiner och MMPs av membrantyp) är en familj av zinkberoende endopeptidaser som kan klyva extracellulär matris (ECM) i läkande sår.3 MMP-8 produceras primärt av neutrofiler och produceras även av andra celler såsom orala epitelceller, plasmaceller och fibroblaster.7 MMP-8 uttrycks under det myelocytiska utvecklingsstadiet av PMN (polymorfonukleär cell) prekursorer i benmärgen29 och lagras som latent enzym (pro-mmp-8) i de specifika granulerna av PMN.30 Pro-MMP-8 frisätts snabbt från aktiverat PMN som genomgår degranulering31 och aktiveras sedan via cysteinväxlingsmekanism för att ge den aktiva formen av enzym.29 MMP-8 (polymorfonukleärt kollagenas5) klyver trippelhelixen av fibrillärt kollagen och har affinitet för typ I kollagen och typ III kollagen5 som finns rikligt i tandköttets bindväv. MMP-8 bryter ned gelatin typ VII, VIII och X kollagen.5 MMP-8 har ansetts vara viktigt för akut sårläkning.6 Bedömning av sårläkningsprogression efter operation är viktig. För närvarande används trubbiga surrogatmarkörer såsom sondering. Begränsningen för dessa markörer är att de representerar läkningens historia och inte den pågående aktiviteten. Eftersom kännetecknet för läkning är kollagenremodellering är det av intresse att studera cytokinprofilen som relaterar till sårläkning. Sådan kunskap kan potentiellt leda till nya diagnostiska strategier för att studera sårläkning på ett bättre sätt som återspeglar läkningsfenotypen.

Kollagenasets funktion under normal sårläkning efter parodontitkirurgi har varit relativt dåligt definierad på grund av bristande studier inom detta område.10 Det mesta av forskningen har koncentrerats på karakteriseringen av MMP-8 under patogenesen av parodontit8 och förändringarna i MMP-8-nivån efter parodontal behandling.

Nwomeh et al studerade MMP-8 från dermal sårläkning genom att samla sårexsudat från ocklusivt bandage. Han noterade att MMP-8 nådde sin topp vid dag 4 och kvarstod i ungefär en vecka. Överuttryck av MMP-8 leder till felaktig läkning.5 Kroniska sår har 30 gånger större MMP än akuta sår. Att hämma överdrivet proteasuttryck i dessa sår kan möjliggöra en prospektiv sårläkningsbehandling.5 Mycket mindre är känt om de cellulära aspekterna av mjukvävnadsläkning i munslemhinnan. Antagandet att oral läkning liknar hudsår kan framkalla förvirring, eftersom det finns vissa subtila skillnader som minskad ärrbildning i hudsår2, roll för IL-1 i orala sår och frånvaro av IL-1 i hudsår11, snabbare läkning i orala sår, närvaro av saliv som hjälper till att läka etc. Sammantaget är det fortfarande en fråga om spekulationer och oklarheter om skillnaderna i det unika läkningsmönstret för orala sår.

Att förstå sårläkning på molekylär nivå ger en djupgående grund för att utveckla behandlingsstrategier som kan förhindra fördröjd läkning.2 Som rekommenderat av Consensus Report från den 10:e europeiska workshopen om parodontologi att det finns ett behov av fler studier på cellnivå för att identifiera cytokiner, kemokin och intracellulära signalnätverk för bättre regenerativa metoder10, utformades den nuvarande kliniska prövningen.

På grund av en avsevärd lucka inom detta område av parodontal forskning, är denna studie planerad för att bedöma MMP-8-nivåerna under postoperativ läkning efter CAF+SCTG-kirurgi för lågkonjunkturtäckning och för att bättre identifiera mekanismen som är involverad i sårläkning. Denna information kan användas för att förhindra att det normala operationssåret förändras läkningsupplevelsen.

6.2 LITTERATURGRANSKNING: Sanctis et al. (2011) genomförde en studie för att fastställa användningen av bindvävstransplantat (CTG) vid rottäckning. Resultaten visade att CAF i samband med SCTG är ett giltigt tillvägagångssätt vid behandling av recessionsdefekter Nwomeh et al. (1999) utvärderade källorna till kollagenaser (MMP-8, MMP-1) och deras aktivitet i normalt läkande sår och kroniska icke-läkande sår. Resultaten visade att MMP-8 är dominerande kollagenas närvarande i normalt läkande sår och att kroniska icke-läkande sår hade ökade nivåer av MMP-1,8 och minskade nivåer av TIMP-1 Armstrong et al (2002) granskade MMP-8s nyckelroll i sårläkning som dominerande kollagenas. Han utvecklade uttrycken för toppnivåer av MMP-8 på dag 4 och 7 under normal sårläkning.

Hammerle et al (2014) fann i en konsensusrapport som granskade de biologiska processerna för sårläkning av mjukvävnad i munhålan att oral läkning av mjukvävnad vid tänder, implantat och tandkammare följer samma fas som hudsårläkning och mänskliga histologiska data är begränsad.

Sorsa et al (2010) jämförde fyra metoder för detektion av gingival crevicular fluid matrix metalloproteinas (MMP-8), dvs immunofluorometerisk analys, dipstick test, dentoAnalyser immunoblot analys och ELISA kit i sin studie och drog slutsatsen att alla analyser är jämförbara och dentoAnalyser är bland första kvantitativa MMP-8-stolsidetestenheter inom periodontal och periimplantatdiagnostik och forskning.

Fernandez et al (2007) genomförde en studie för att undersöka rollen av MMP_8 i kutan sårläkning. De observerade signifikant fördröjning i sårtillslutningen hos MMP-8 -/- möss och ett förändrat inflammatoriskt svar i deras sår. De indikerade att MMP-8 deltar i sårreparation genom upplösning av inflammation och öppnar möjligheten att utveckla nya strategier för behandling av sårläkningsdefekter.

Mohd H et al (1999)19 utvärderade nivåerna av MMP-8 och MMP-3 under den tidiga läkningsfasen efter en guidad vävnadsregenereringsprocedur genom att utvärdera GCF-prover (Gingival Crevicular Fluid) för kvantifiering av MMP-8 och MMP-3. De fann att närvaron av membranet verkade öka nivåerna av MMP-3 och -8 och relatera till resorptionen av det bioresorberbara membranet av värdsystem.

Dickinson et al (2013) studerade de tidiga händelserna i parodontal regenerering i hundens supraalveolära parodontala defektmodell genom att använda histologiska och immunologiska tekniker och drog slutsatsen att aktivering av cellulära regenerativa händelser vid periodontal sårregenerering är snabb, det allmänna ramverket för vävnadsbildning (ben) , parodontala ligament och bindväv) beskrivs i stora drag inom 14 dagar.

Shaw et al (2009) granskade sårreparation med en blick och beskrev den komplexa processen med sårreparation. Han betonade att ombyggnaden av extracellulär matris åstadkoms genom en delikat balans av MMP.

Teles et al (2010) mätte nivåerna av GCF-biomarkörer och subgingivala bakteriearter hos parodontalt friska och parodontitpatienter. Han drog slutsatsen att kliniskt friska platser från parodontitpatienter uppvisar högre nivåer av GCF-biomarkörer och parodontala patogener än platser från friska personer.

6.3 Syfte med studien: Det primära syftet med denna studie är att utvärdera effekten och inverkan av CAF+SCTG för rottäckning i Millers klass I och II gingivala recessionsplatser på MMP-8-nivåerna i GCF och serum.

Det sekundära målet är att testa användbarheten av baslinjens MMP-8-nivå för att förutsäga kategoriskt bedömda behandlingsresultat och korrelera det med ett tidigt sårläkningsmönster efter CAF+SCTG för rottäckning.

MATERIAL OCH METODER:

7.1 Datakälla:

Patienter som besöker den polikliniska avdelningen för parodontologi, Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital och som uppfyller kriterierna för inkludering och uteslutning kommer att screenas och väljas ut för studien.

Den experimentella designen kommer att bestå av totalt 15-20 platser som kommer att rekryteras för studien enligt inklusions- och exkluderingskriterierna. Patienterna kommer att informeras om det kirurgiska ingreppet och det material som används för studien och ett informerat samtycke kommer att erhållas från patienterna.

7.2 Metod för insamling av data:

Provstorlek:

Denna prospektiva studie kommer att vara en enda blind jämförande klinisk kontrollstudie med 15-20 patienter med Millers klass I och II recessionsdefekter i den främre överkäken.

Provtagningsteknik

• Efter screeningundersökningar i den inledande fasen kommer varje försöksperson att få en session med munhygieninstruktioner, skalning och rotplanering med ultraljudsskalare och manuella kyretter.
• Kirurgisk behandling av recessionsdefekt kommer inte att schemaläggas förrän patienten kan visa en adekvat standard för supragingival plackkontroll (plackpoäng <20 % O Leary 1972). De nedan nämnda kliniska parametrarna kommer att registreras till närmaste millimeter med hjälp av en UNC-15-sond (University of North Carolina -15 periodontal sond -Hu Friedy, Chicago, IL, USA) och mätande ocklusala stentar för positionering av mätsonder kommer att tillverkas med kallhärdad akrylharts på en gjuten modell erhållen från ett alginatavtryck. Den kommer att vara konstruerad så att den täcker de ocklusala ytorna på tanden som behandlas och ocklusala ytorna på åtminstone en tand i mesiala och distala riktningar. Den kommer också att förlängas apikalt på de buckala och linguala ytorna för att täcka den koronala tredjedelen av tänderna. Tre spår kommer att markeras på stenten vid mesio-buckala, mid-buckala och disto-buckala platser som referenspunkter15 så att postkirurgiska mätningar kommer att göras vid samma position och vinkling som de som gjordes före operationen, dvs. baslinjemätningar sedan efter 6 månader.
• GCF-provet kommer att samlas in från tandköttets sulcus av tanden som är indicerat för rottäckningsprocedur (negativ kontroll) och från en annan tand med kliniskt frisk gingiva (positiv kontroll). Proverna kommer att samlas in vid baslinjen och vid efterföljande postkirurgisk uppföljning (fjärde dagen, sjunde dagen och 6 månader).

Kliniska mätningar:

Följande kliniska mätning kommer att registreras vid baslinjen och efter 6 månader.

1. Gingival recession djup (GRD), mätt som avståndet mellan CEJ och gingival marginal.17
2. Gingival recession Width (GRW), mätt som avståndet mellan mesial gingival marginal och distal gingival marginal.17
3. Probing Depth (PD), mätt som avståndet från gingival marginal till basen av gingival sulcus.17
4. Clinical Attachment Level (CAL), mätning från CEJ (Cementoenamel junction) till basen av gingival sulcus.17
5. Apico koronal bredd av keratinerad vävnad (KTW) mätt som avståndet från mucogingival junction till gingivalmarginalen.17
6. Sårläkningsindex (WHI) kommer att bedömas på 4:e och 7:e dagen (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Plackindex (Sillness and Loe, 1964)
8. Gingivalindex (Loe and Sillness, 1963)
9. Gingival blödningsindex (Ainamo och Bay, 1975)

KIRURGISK PROCEDUR:

• Innan operationen påbörjas kommer rotytor nära buckal fästförlust att instrumenteras med mini-fem Gracey Currettes och den mekaniska behandlingen kommer att avslutas när släta och hårda rotytor erhålls.16
• Under lokalbedövning 2 % lignokainhydroklorid (Ligox 2 %, Indoco Remedies Ltd, Goa, Indien) med ett blad nr. 15 BP (Bard Parker) kommer ett submarginalt snitt att göras i den buckala delen av den behandlade tanden och förlängas 3 mm. horisontellt i den mesiala och distala interdentala gingiva. Ett intrasulkulärt snitt kommer att göras vid den buckala delen av den inblandade tanden. Två sneda, divergerande släppande snitt kommer att följas, som sträcker sig bortom den mukogingivala förbindelsen.
• En flik av full tjocklek kommer att höjas till MGJ (mucogingival junction) med en liten periosteal hiss. Därefter kommer en flik av partiell tjocklek att höjas bortom mukogingivalövergången för att möjliggöra en passiv koronal förskjutning av fliken som helt täcker CEJ utan spänning.16
• Rotplanering kommer att göras med en vass curette. Papillerna intill den behandlade tanden kommer att avepiteliseras för att skapa en blödande yta för en mottagarbädd, där SCTG kommer att placeras.
• Donatorstället som består av 2 mm tjockt palatalt bindvävstransplantat kommer att skördas från premolar till första molarområde med hjälp av "fälldörr"-tekniken.14 Bindvävstransplantatet kommer att säkras på plats med 4-0 absorberbara suturer på mottagarställena.
• Flikarna kommer att stabiliseras med slingsutur i koronal position, följt av avbruten sutur vid frigörande av snitt i apiko-koronal riktning med hjälp av 4-0 absorberbara suturer.14
• Operationsställena kommer att skyddas med ett icke-eugenol parodontalt förband. Postoperativa instruktioner kommer att bestå av 0,2 % klorhexidin munsköljning 3 gånger dagligen i 3 veckor och Ibuprofen 600 mg för smärtkontroll i tre dagar. 33
• Suturer kommer att tas bort 7 dagar efter operationen och efter detta kommer patienterna att återinstrueras i mekanisk rengöring av behandlade tänder med hjälp av mjuk tandborste.33
• Återkallelse och förstärkning av munhygieninstruktioner kommer att göras varannan månad.

Gingival crevicular fluid (GCF) provtagning och ELISA:

• Försökspersonerna kommer att sitta bekvämt i upprätt position på tandläkarstolen och den valda platsen kommer att vara väl upplyst.
• GCF-prover kommer att samlas in efter plackindex men före alla andra kliniska registreringar som skulle orsaka vävnadsirritation och blodkontamination av provet.19 Under den 4:e och 7:e dagen efter kirurgisk uppföljning kommer det parodontala förbandet att försiktigt tas bort och GCF-prover kommer att samlas in från tandköttets sulcus.
• Efter att området försiktigt har torkats med en blåst luft, kommer supragingivalt plack att avlägsnas utan att röra den marginala gingiva. Området kommer att isoleras med bomullsrullar för att förhindra kontaminering av saliv och GCF kommer att samlas in genom att föra in standardpappersremsor (periopapper; oraflow Inc., Smithtown, NY, USA) i springan tills mild motstånd känns i 30 sekunder.19
• GCF-provvolymen kommer att mätas i en kalibrerad apparat (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM, varefter avläsningarna kommer att omvandlas till en faktisk volym (µl) med hänvisning till standardkurvan. Remsorna från den valda platsen kommer att överföras i mikrocentrifugerade rör innehållande 200 (µl) fosfatbuffertsaltlösning.19

Serumprovtagning:

• Åtta milliliter (8 ml) blod kommer att samlas upp från antecubital fossa efter 12 timmars fasta på morgonen med en 20-gage nål med 2 ml sprutor och kommer omedelbart att överföras till laboratoriet.
• Blodprovet kommer att tillåtas koagulera vid rumstemperatur i en timme, serum kommer att extraheras från blod genom centrifugering vid 3000 rpm i 15 minuter. Serumprov kommer omedelbart att överföras till en plastflaska och förvaras vid -800°C tills analystillfället34 utförs med Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) kit.

Resultat:

Det primära resultatet som mäts kommer att vara:

• MMP-8-nivåer i GCF och serum vid baslinjen och efterföljande postkirurgisk uppföljning efter CAF+SCTG-ingrepp (4:e, 7:e och 6 månader).
• Kvantitativ analys av GCF-prover vid baslinjen och 4:e, 7:e och 6 månader efter kirurgisk uppföljning.
• Korrelation mellan GCF och serum MMP-8 värden vid baslinjen och 4:e, 7:e och 6 månader efter kirurgisk uppföljning.

Det sekundära resultatet som mäts kommer att vara:

1. Sårläkningsindex (WHI) kommer att bedömas på 4:e och 7:e dagen
2. Gingival recessionsdjup (GRD)
3. Gingival recession Width (GRW)
4. Sonddjup (PD)
5. Clinical Attachment Level (CAL)
6. Apico koronal bredd av keratinerad vävnad (KTW)
7. Plack Index, Gingival Index och Gingival Bleeding Index

Alla ovanstående parametrar kommer att korreleras med MMP-8-nivåerna.

Statistisk analys

De erhållna värdena kommer att jämföras mellan GCF och serum med användning av ANOVA-test. Medelskillnader vid olika tidsintervall från baslinjevärdet kommer att testas med Mann-Whitney U-test separat. Ett 'p'-värde på < 0,05 kommer att anses vara statistiskt signifikant.