Stima dei livelli di MMP-8 nel GCF e nel siero e sua correlazione con la guarigione delle ferite e gli esiti clinici dopo lembo avanzato coronalmente e innesto di tessuto connettivo sottoepiteliale per la copertura radicolare nei difetti di recessione: UNO STUDIO CLINICO-BIOCHIMICO

NECESSITÀ PER LO STUDIO:

Il lembo avanzato coronalmente con la tecnica dell'innesto di tessuto connettivo subepiteliale (CAF+SCTG) ha dimostrato di essere una delle modalità di maggior successo per la copertura radicolare.1 Il successo di qualsiasi procedura chirurgica dipende dalla guarigione della ferita.

La guarigione delle ferite dopo la procedura chirurgica è un evento complesso e altamente orchestrato che comprende la fase emostatica, la fase infiammatoria, la fase di formazione di nuovo tessuto e la fase finale di rimodellamento che lascia dietro di sé una matrice extracellulare ricca di collagene (ECM) e un tessuto denso e stabile.2 Durante la guarigione della ferita, il coagulo fornisce una base per la futura ECM. L'ECM svolge un ruolo fondamentale per stimolare la migrazione cellulare, l'adesione, la contrazione della ferita e l'epitelizzazione. Questo ruolo cruciale dell'ECM è mantenuto da un gruppo di enzimi noti collettivamente come Matrix Metalloproteinases (MMP). Le MMP svolgono un ruolo centrale nella guarigione delle ferite.3,4 La mancata regolazione di queste MMP è stata correlata a difetti di cicatrizzazione della ferita.3,4 MMP (es. collagenasi, gelatinasi, matrilisine, stromelisine e MMP di tipo membrana) sono una famiglia di endopeptidasi zinco-dipendenti in grado di scindere la matrice extracellulare (ECM) nelle ferite in via di guarigione.3 Le MMP-8 sono prodotte principalmente dai neutrofili e sono prodotte anche da altre cellule come le cellule epiteliali orali, le plasmacellule e i fibroblasti.7 Le MMP-8 sono espresse durante la fase mielocitica di sviluppo dei precursori delle PMN (cellule polimorfonucleate) nel midollo osseo29 e viene immagazzinato come enzima latente (pro-mmp-8) all'interno dei granuli specifici di PMN.30 Pro-MMP-8 viene rapidamente rilasciato dal PMN attivato sottoposto a degranulazione31 e quindi attivato tramite il meccanismo di commutazione della cisteina per produrre la forma attiva dell'enzima.29 MMP-8 (collagenasi polimorfonucleare5) scinde la tripla elica del collagene fibrillare e ha affinità per il tipo I collagene e collagene di tipo III5 che si trova abbondantemente nel tessuto connettivo della gengiva. L'MMP-8 degrada il collagene di tipo VII, VIII e X della gelatina.5 MMP-8 è stato implicato per essere importante per la guarigione delle ferite acute.6 La valutazione della progressione della guarigione della ferita dopo l'intervento chirurgico è importante. Attualmente vengono utilizzati marker surrogati smussati come il sondaggio. La limitazione di questi marcatori è che rappresenta la storia della guarigione e non l'attività in corso. Poiché il segno distintivo della guarigione è il rimodellamento del collagene, è interessante studiare il profilo delle citochine che si riferisce alla guarigione della ferita. Tale conoscenza può potenzialmente portare a nuove strategie diagnostiche per studiare la guarigione delle ferite in un modo migliore che rifletta il fenotipo di guarigione.

La funzione della collagenasi durante la normale guarigione della ferita dopo la chirurgia parodontale è stata relativamente mal definita a causa della mancanza di studi in questo settore.10 La maggior parte della ricerca si è concentrata sulla caratterizzazione di MMP-8 durante la patogenesi della malattia parodontale8 e sui cambiamenti del livello di MMP-8 dopo il trattamento parodontale.

Nwomeh et al hanno studiato l'MMP-8 dalla guarigione della ferita cutanea raccogliendo l'essudato della ferita dal bendaggio occlusivo. Ha notato che l'MMP-8 ha raggiunto il picco al giorno 4 e ha persistito per circa una settimana. La sovraespressione di MMP-8 porta a una guarigione difettosa.5 Le ferite croniche hanno MMP 30 volte maggiori rispetto alle ferite acute. L'inibizione dell'eccessiva espressione di proteasi in queste ferite può consentire un potenziale trattamento di guarigione della ferita.5 Molto poco si sa sugli aspetti cellulari della guarigione dei tessuti molli nella mucosa orale. Il presupposto che la guarigione orale sia simile alle ferite cutanee potrebbe provocare confusione, in quanto vi sono alcune sottili differenze come la ridotta formazione di cicatrici nelle ferite cutanee2, il ruolo dell'IL-1 nelle ferite orali e l'assenza di IL-1 nelle ferite cutanee11, la guarigione più rapida nelle ferite orali, presenza di saliva che aiuta nella guarigione ecc. Nel complesso è ancora oggetto di speculazione e ambiguità sulle differenze nel modello di guarigione unico delle ferite orali.

Comprendere la guarigione delle ferite a livello molecolare fornisce una base approfondita per sviluppare strategie di trattamento in grado di prevenire il ritardo della guarigione.2 Come raccomandato dal Consensus Report del 10° workshop europeo sulla parodontologia, secondo cui sono necessari ulteriori studi a livello cellulare per identificare citochine, chemochine e reti di segnalazione intracellulare per migliori approcci rigenerativi10, è stato progettato il presente studio clinico.

A causa di una notevole lacuna in quest'area della ricerca parodontale, questo studio è progettato per valutare i livelli di MMP-8 durante la guarigione post-operatoria dopo l'intervento chirurgico CAF + SCTG per la copertura della recessione e per identificare meglio il meccanismo coinvolto nella guarigione della ferita. Queste informazioni possono essere utilizzate per evitare che la normale ferita chirurgica subisca un'esperienza di guarigione alterata.

6.2 REVISIONE DELLA LETTERATURA: Sanctis et al. (2011) hanno condotto uno studio per determinare l'uso dell'innesto di tessuto connettivo (CTG) nella copertura radicolare. I risultati hanno dimostrato che CAF in associazione con SCTG è un approccio valido nel trattamento dei difetti di recessione Nwomeh et al. (1999) hanno valutato le fonti di collagenasi (MMP-8, MMP-1) e la loro attività nelle normali ferite cicatrizzanti e nelle ulcere croniche non cicatrizzanti. I risultati hanno mostrato che l'MMP-8 è la collagenasi predominante presente nelle normali ferite in via di guarigione e nelle ulcere croniche non in via di guarigione con livelli aumentati di MMP-1,8 e livelli ridotti di TIMP-1 Armstrong et al (2002) hanno rivisto il ruolo chiave dell'MMP-8 in guarigione delle ferite come collagenasi predominante. Ha elaborato le espressioni dei livelli di picco di MMP-8 al giorno 4 e 7 durante la normale guarigione della ferita.

Hammerle et al (2014) in un rapporto di consenso che ha esaminato i processi biologici di guarigione delle ferite dei tessuti molli nella cavità orale, ha scoperto che la guarigione dei tessuti molli orali a livello di denti, impianti e cresta edentula segue la stessa fase della guarigione delle ferite della pelle e i dati istologici umani sono limitato.

Sorsa et al (2010) hanno confrontato quattro metodi per il rilevamento della metalloproteinasi della matrice del fluido crevicolare gengivale (MMP-8), ovvero il test immunofluorimetrico, il test del dip stick, il test immunoblot dentoAnalyser e il kit ELISA nel loro studio e hanno concluso che tutti i test sono comparabili e dentoAnalyser è tra i primi dispositivi di test quantitativi alla poltrona MMP-8 nella diagnostica e nella ricerca parodontale e perimplantare.

Fernandez et al (2007) hanno condotto uno studio per studiare il ruolo di MMP_8 nella guarigione delle ferite cutanee. Hanno osservato un significativo ritardo nella chiusura della ferita nei topi MMP-8 -/- e un'alterata risposta infiammatoria nelle loro ferite. Hanno indicato che MMP-8 partecipa alla riparazione delle ferite attraverso la risoluzione dell'infiammazione e aprono la possibilità di sviluppare nuove strategie per il trattamento dei difetti di guarigione delle ferite.

Mohd H et al (1999)19 hanno valutato i livelli di MMP-8 e MMP-3 durante la fase di guarigione iniziale a seguito di una procedura di rigenerazione tissutale guidata valutando campioni GCF (Gingival Crevicular Fluid) per la quantificazione di MMP-8 e MMP-3. Hanno scoperto che la presenza della membrana sembra aumentare i livelli di MMP-3 e -8 e si riferisce al riassorbimento della membrana bioriassorbibile da parte dei sistemi ospiti.

Dickinson et al (2013) hanno studiato i primi eventi nella rigenerazione parodontale nel modello di difetto parodontale sopraalveolare canino utilizzando tecniche istologiche e immunologiche e hanno concluso che l'attivazione degli eventi rigenerativi cellulari nella rigenerazione della ferita parodontale è rapida, il quadro generale della formazione del tessuto (osso , legamento parodontale e tessuto connettivo) è ampiamente delineato entro 14 giorni.

Shaw et al (2009) hanno esaminato la riparazione delle ferite a colpo d'occhio e hanno descritto il complesso processo di riparazione delle ferite. Ha sottolineato che il rimodellamento della matrice extracellulare è realizzato da un delicato equilibrio di MMP.

Teles et al (2010) hanno misurato i livelli di biomarcatori GCF e specie batteriche subgengivali in soggetti parodontalmente sani e con parodontite. Ha concluso che i siti clinicamente sani di soggetti con parodontite presentano livelli più elevati di biomarcatori GCF e patogeni parodontali rispetto ai siti di soggetti sani.

6.3 Obiettivo dello studio: L'obiettivo principale di questo studio è valutare l'effetto e l'impatto di CAF+SCTG per la copertura radicolare nei siti di recessione gengivale di classe Millers I e II sui livelli di MMP-8 nel GCF e nel siero.

L'obiettivo secondario è testare l'utilità del livello basale di MMP-8 nella previsione dei risultati del trattamento valutati in modo categorico e correlarlo con il modello di guarigione precoce della ferita dopo CAF + SCTG per la copertura radicolare.

MATERIALI E METODI:

7.1 Fonte dei dati:

I pazienti che visitano il Dipartimento ambulatoriale di Parodontologia, il Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital e che soddisfano i criteri di inclusione ed esclusione saranno sottoposti a screening e selezionati per lo studio.

Il disegno sperimentale sarà composto da un totale di 15-20 siti che saranno reclutati per lo studio secondo i criteri di inclusione ed esclusione. I pazienti saranno informati sulla procedura chirurgica e sui materiali utilizzati per lo studio e sarà ottenuto un consenso informato dai pazienti.

7.2 Modalità di raccolta dei dati:

Misura di prova:

Questo studio prospettico sarà uno studio di controllo clinico comparativo in singolo cieco con 15-20 pazienti con difetti di recessione di classe I e II di Miller nell'arco mascellare anteriore.

Tecnica di campionamento

• Dopo gli esami di screening nella fase iniziale, ogni soggetto riceverà una sessione di istruzione di igiene orale, detartrasi e levigatura radicolare con scaler ad ultrasuoni e curette manuali.
• Il trattamento chirurgico del difetto di recessione non sarà programmato fino a quando il paziente non dimostrerà un adeguato standard di controllo della placca sopragengivale (punteggio della placca <20% O Leary 1972). I parametri clinici sotto menzionati saranno registrati al millimetro più vicino utilizzando una sonda UNC-15 (sonda parodontale dell'Università della Carolina del Nord -15 -Hu Friedy, Chicago, IL, USA) e la misurazione degli stent occlusali per il posizionamento delle sonde di misurazione sarà fabbricata con resina acrilica indurita a freddo su modello fuso ottenuto da un'impronta in alginato. Sarà costruito in modo tale da coprire le superfici occlusali del dente da trattare e le superfici occlusali di almeno un dente in direzione mesiale e distale. Sarà anche esteso apicalmente sulle superfici buccali e linguali per coprire il terzo coronale dei denti. Tre scanalature saranno contrassegnate sullo stent nei siti mesio-vestibolare, medio-vestibolare e disto-vestibolare come punti di riferimento15 in modo che la misurazione post-chirurgica venga effettuata nella stessa posizione e angolazione di quelle effettuate prima dell'intervento, vale a dire le misurazioni di riferimento quindi dopo 6 mesi.
• Il campione GCF sarà prelevato dal solco gengivale del dente indicato per la procedura di copertura radicolare (controllo negativo) e da un altro dente con gengiva clinicamente sana (controllo positivo). I campioni saranno raccolti al basale e al successivo follow-up post-chirurgico (quarto giorno, settimo giorno e 6 mesi).

Misure cliniche:

La seguente misurazione clinica sarà registrata al basale e dopo 6 mesi.

1. Profondità di recessione gengivale (GRD), misurata come la distanza tra la CEJ e il margine gengivale.17
2. Larghezza di recessione gengivale (GRW), misurata come la distanza tra il margine gengivale mesiale e il margine gengivale distale.17
3. Probing Depth (PD), misurata come la distanza dal margine gengivale alla base del solco gengivale.17
4. Livello di attacco clinico (CAL), misurazione dalla CEJ (giunzione Cementoenamel) alla base del solco gengivale.17
5. Larghezza apico-coronale del tessuto cheratinizzato (KTW) misurata come la distanza dalla giunzione mucogengivale al margine gengivale.17
6. Gli indici di guarigione delle ferite (WHI) saranno valutati il ​​4° e 7° giorno (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Indice di placca (Sillness and Loe, 1964)
8. Indice gengivale (Loe e Sillness, 1963)
9. Indice di sanguinamento gengivale (Ainamo e Bay, 1975)

OPERAZIONE CHIRURGICA:

• Prima di iniziare l'intervento chirurgico, le superfici radicolari vicine alla perdita di attacco buccale saranno strumentate con mini-cinque Gracey Currettes e il trattamento meccanico terminerà quando si otterranno superfici radicolari lisce e dure.16
• In anestesia locale cloridrato di lignocaina al 2% (Ligox 2%, Indoco Remedies Ltd, Goa, India) utilizzando una lama n. 15 BP (Bard Parker), verrà praticata un'incisione submarginale sull'aspetto vestibolare del dente trattato ed estesa di 3 mm orizzontalmente nella gengiva interdentale mesiale e distale. Verrà praticata un'incisione intrasulculare sull'aspetto vestibolare del dente interessato. Seguiranno due incisioni di rilascio oblique e divergenti, che si estendono oltre la giunzione mucogengivale.
• Un lembo a tutto spessore verrà sollevato fino al MGJ (giunzione mucogengivale) utilizzando un piccolo scollaperiostio. Successivamente, un lembo a spessore parziale verrà sollevato oltre la giunzione mucogengivale per consentire uno spostamento coronale passivo del lembo coprendo completamente la CEJ senza tensione.16
• La pianificazione della radice verrà eseguita utilizzando una curette affilata. Le papille adiacenti al dente trattato verranno disepitelizzate per creare una superficie sanguinante per un letto ricevente, dove verrà posizionato SCTG.
• Il sito donatore costituito da un innesto di tessuto connettivo palatale di 2 mm di spessore verrà prelevato dal premolare all'area del primo molare utilizzando la tecnica della "botola".14 L'innesto di tessuto connettivo sarà fissato in posizione con suture riassorbibili 4-0 nei siti riceventi.
• I lembi saranno stabilizzati con sutura a fionda in posizione coronale, seguita da sutura interrotta su incisioni di rilascio in direzione apico-coronale utilizzando suture assorbibili 4-0.14
• I siti chirurgici saranno protetti con una medicazione parodontale priva di eugenolo. Le istruzioni postoperatorie consisteranno in sciacqui con clorexidina allo 0,2% 3 volte al giorno per 3 settimane e ibuprofene 600 mg per il controllo del dolore per tre giorni. 33
• Le suture verranno rimosse 7 giorni dopo l'intervento chirurgico e dopo questo i pazienti verranno nuovamente istruiti nella pulizia meccanica dei denti trattati con l'uso di uno spazzolino morbido.33
• Il richiamo e il rafforzamento delle istruzioni per l'igiene orale verranno effettuati ogni 2 mesi.

Prelievo di fluido crevicolare gengivale (GCF) ed ELISA:

• I soggetti saranno seduti comodamente in posizione eretta sulla poltrona del dentista e il sito selezionato sarà ben illuminato.
• I campioni GCF verranno raccolti dopo l'indice di placca ma prima di qualsiasi altra registrazione clinica che potrebbe causare irritazione dei tessuti e contaminazione del sangue del campione.19 Durante il 4° e 7° giorno di follow-up post-chirurgico, la medicazione parodontale verrà delicatamente rimossa e verranno prelevati campioni di GCF dal solco gengivale.
• Dopo aver asciugato delicatamente l'area con un getto d'aria, la placca sopragengivale verrà rimossa senza toccare la gengiva marginale. L'area verrà isolata con rulli di cotone per prevenire la contaminazione da saliva e il GCF verrà raccolto inserendo strisce di carta standard (carta perio; oraflow Inc., Smithtown, NY, USA) nella fessura fino a quando non si avverte una leggera resistenza per 30 secondi.19
• Il volume del campione GCF verrà misurato in un apparecchio calibrato (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, USA)TM, dopodiché le letture verranno convertite in un volume effettivo (µl) facendo riferimento alla curva standard. Le strisce dal sito selezionato verranno trasferite in provette microcentrifugate contenenti 200 (µl) di tampone fosfato salino.19

Campione di siero:

• Otto millilitri (8 ml) di sangue verranno raccolti dalla fossa antecubitale dopo 12 ore di digiuno al mattino utilizzando un ago da 20 con siringhe da 2 ml e saranno immediatamente trasferiti al laboratorio.
• Il campione di sangue verrà lasciato coagulare a temperatura ambiente per un'ora, il siero verrà estratto dal sangue mediante centrifugazione a 3000 rpm per 15 minuti. Il campione di siero verrà immediatamente trasferito in una fiala di plastica e conservato a -80°C fino al momento del test34 eseguito utilizzando il kit ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).

Risultato:

L'outcome primario misurato sarà:

• Livelli di MMP-8 nel GCF e nel siero al basale e al successivo follow-up post-chirurgico dopo la procedura CAF+SCTG (4°, 7° e 6° mese).
• Analisi quantitativa dei campioni di GCF al basale e al follow-up post-chirurgico a 4, 7 e 6 mesi.
• Correlazione dei valori di GCF e MMP-8 sierica al basale e al follow-up post-chirurgico a 4, 7 e 6 mesi.

L'esito secondario misurato sarà:

1. Gli indici di guarigione delle ferite (WHI) saranno valutati il ​​4° e il 7° giorno
2. Profondità recessione gengivale (GRD)
3. Larghezza recessione gengivale (GRW)
4. Profondità di sondaggio (PD)
5. Livello di attaccamento clinico (CAL)
6. Larghezza apico coronale del tessuto cheratinizzato (KTW)
7. Indice di placca, indice gengivale e indice di sanguinamento gengivale

Tutti i suddetti parametri saranno correlati con i livelli di MMP-8.

analisi statistica

I valori ottenuti saranno confrontati tra GCF e siero utilizzando il test ANOVA. Le differenze medie a diversi intervalli di tempo dal valore basale saranno testate usando il test U di Mann-Whitney separatamente. Un valore 'p' < 0,05 sarà considerato statisticamente significativo.