Estimación de los niveles de MMP-8 en GCF y suero y su correlación con la cicatrización de heridas y los resultados clínicos después de un colgajo avanzado coronalmente y un injerto de tejido conjuntivo subepitelial para la cobertura radicular en defectos de recesión: UN ESTUDIO CLÍNICO-BIOQUÍMICO

NECESIDAD DEL ESTUDIO:

La técnica de colgajo de avance coronal con injerto de tejido conectivo subepitelial (CAF+SCTG) ha demostrado ser una de las modalidades más exitosas para la cobertura radicular.1 El éxito de cualquier procedimiento quirúrgico depende de la cicatrización de la herida.

La cicatrización de heridas después del procedimiento quirúrgico es un evento complejo y altamente orquestado que incluye la fase hemostática, la fase inflamatoria, la fase de formación de tejido nuevo y la fase final de remodelación, dejando atrás una matriz extracelular rica en colágeno (MEC) y un tejido denso y estable.2 Durante la cicatrización de heridas, el coágulo proporciona una base para la futura MEC. La ECM juega un papel vital para impulsar la migración celular, la adhesión, la contracción de la herida y la epitelización. Este papel crucial de la MEC lo mantiene un grupo de enzimas conocidas colectivamente como metaloproteinasas de matriz (MMP). Las MMP juegan un papel central en la cicatrización de heridas.3,4 La falta de regulación de estas MMP se ha correlacionado con una cicatrización defectuosa de heridas.3,4 MMP (es decir, colagenasas, gelatinasas, matrilisinas, estromelisinas y MMP de tipo membrana) son una familia de endopeptidasas dependientes de zinc capaces de escindir la matriz extracelular (MEC) en la cicatrización de heridas.3 Las MMP-8 son producidas principalmente por los neutrófilos y también por otras células, como las células epiteliales orales, las células plasmáticas y los fibroblastos.7 Las MMP-8 se expresan durante la etapa mielocítica de desarrollo de los precursores de PMN (células polimorfonucleares) en la médula ósea29 y se almacena como enzima latente (pro-mmp-8) dentro de los gránulos específicos de PMN.30 Pro-MMP-8 se libera rápidamente de los PMN activados que experimentan desgranulación31 y luego se activa a través del mecanismo de cambio de cisteína para producir la forma activa de la enzima.29 MMP-8 (colagenasa polimorfonuclear5) escinde la triple hélice del colágeno fibrilar y tiene afinidad por el tipo I colágeno y colágeno tipo III5 que se encuentra abundantemente en el tejido conectivo de la encía. MMP-8 degrada gelatina tipo VII, VIII y X colágeno.5 Se ha implicado que la MMP-8 es importante para la cicatrización de heridas agudas.6 La evaluación de la progresión de la cicatrización de heridas después de la cirugía es importante. Actualmente se utilizan marcadores sustitutos romos como el sondaje. La limitación de estos marcadores es que representa la historia de curación y no la actividad en curso. Dado que el sello distintivo de la cicatrización es la remodelación del colágeno, es de interés estudiar el perfil de citoquinas que se relaciona con la cicatrización de heridas. Tal conocimiento puede conducir potencialmente a nuevas estrategias de diagnóstico para estudiar la curación de heridas de una mejor manera que refleje el fenotipo de curación.

La función de la colagenasa durante la cicatrización normal de heridas después de la cirugía periodontal ha sido relativamente mal definida debido a la falta de estudios en esta área.10 La mayor parte de la investigación se ha concentrado en la caracterización de MMP-8 durante la patogénesis de la enfermedad periodontal8 y los cambios en el nivel de MMP-8 después del tratamiento periodontal.

Nwomeh et al estudiaron la MMP-8 de la cicatrización de heridas dérmicas al recolectar el exudado de la herida del vendaje oclusivo. Señaló que MMP-8 alcanzó su punto máximo en el día 4 y persistió durante aproximadamente una semana. La sobreexpresión de MMP-8 conduce a una cicatrización defectuosa.5 Las heridas crónicas tienen 30 veces más MMP que las heridas agudas. La inhibición de la expresión excesiva de proteasa en estas heridas puede permitir un posible tratamiento de cicatrización de heridas.5 Se sabe muy poco sobre los aspectos celulares de la cicatrización de los tejidos blandos en la mucosa oral. La suposición de que la cicatrización oral es similar a las heridas dérmicas podría provocar confusión, ya que existen ciertas diferencias sutiles como la formación de cicatrices reducidas en las heridas dérmicas2, el papel de la IL-1 en las heridas orales y la ausencia de IL-1 en las heridas dérmicas11, la curación más rápida en heridas orales, presencia de saliva que ayuda en la cicatrización, etc. En general, sigue siendo un tema de especulación y ambigüedad acerca de las diferencias en el patrón único de curación de las heridas orales.

Comprender la cicatrización de heridas a nivel molecular proporciona una base profunda para desarrollar estrategias de tratamiento que puedan prevenir el retraso en la cicatrización.2 Según lo recomendado por el Informe de Consenso del 10.º taller europeo sobre periodontología de que se necesitan más estudios a nivel celular para identificar redes de señalización de citocinas, quimiocinas e intracelulares para mejores enfoques regenerativos10, se diseñó el presente ensayo clínico.

Debido a las lagunas considerables en esta área de investigación periodontal, este estudio está planificado para evaluar los niveles de MMP-8 durante la cicatrización posoperatoria después de la cirugía CAF+SCTG para cubrir la recesión e identificar mejor el mecanismo involucrado en la cicatrización de heridas. Esta información se puede utilizar para evitar que la herida quirúrgica normal experimente una cicatrización alterada.

6.2 REVISIÓN DE LA LITERATURA: Sanctis et al. (2011) realizaron un estudio para determinar el uso de injerto de tejido conectivo (CTG) en el cubrimiento radicular. Los resultados demostraron que CAF en asociación con SCTG es un enfoque válido en el tratamiento de los defectos de recesión Nwomeh et al. (1999) evaluaron las fuentes de colagenasas (MMP-8, MMP-1) y su actividad en heridas con cicatrización normal y úlceras crónicas que no cicatrizan. Los resultados mostraron que la MMP-8 es una colagenasa predominante presente en heridas con cicatrización normal y las úlceras crónicas que no cicatrizan tenían un nivel elevado de MMP-1,8 y niveles reducidos de TIMP-1 Armstrong et al (2002) revisaron el papel clave de MMP-8 en cicatrización de heridas como colagenasa predominante. Elaboró ​​las expresiones de los niveles máximos de MMP-8 en los días 4 y 7 durante la cicatrización normal de heridas.

Hammerle et al (2014) en un informe de consenso que revisó los procesos biológicos de cicatrización de heridas de tejidos blandos en la cavidad oral, encontró que la cicatrización de tejidos blandos orales en dientes, implantes y cresta edéntula sigue la misma fase que la cicatrización de heridas en la piel y los datos histológicos humanos son limitado.

Sorsa et al (2010) compararon cuatro métodos para la detección de metaloproteinasas de la matriz del líquido crevicular gingival (MMP-8), es decir, ensayo inmunofluorométrico, prueba de tira reactiva, ensayo de inmunotransferencia dentoAnalyser y kit ELISA en su estudio y concluyeron que todos los ensayos son comparables y que dentoAnalyser es entre los primeros dispositivos de prueba cuantitativos MMP-8 en el lado del sillón en diagnóstico e investigación periodontal y periimplantario.

Fernandez et al (2007) realizaron un estudio para investigar el papel de MMP_8 en la cicatrización de heridas cutáneas. Observaron un retraso significativo en el cierre de heridas en ratones MMP-8 -/- y una respuesta inflamatoria alterada en sus heridas. Indicaron que MMP-8 participa en la reparación de heridas mediante la resolución de la inflamación y abren la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias para tratar los defectos de cicatrización de heridas.

Mohd H et al (1999)19 evaluaron los niveles de MMP-8 y MMP-3 durante la fase de curación temprana después de un procedimiento de regeneración tisular guiada mediante la evaluación de muestras de GCF (líquido crevicular gingival) para la cuantificación de MMP-8 y MMP-3. Descubrieron que la presencia de la membrana parecía aumentar los niveles de MMP-3 y -8 y se relacionaba con la reabsorción de la membrana bioabsorbible por parte de los sistemas del huésped.

Dickinson et al (2013) estudiaron los eventos tempranos en la regeneración periodontal en el modelo de defecto periodontal supraalveolar canino mediante el uso de técnicas histológicas e inmunológicas y concluyeron que la activación de eventos regenerativos celulares en la regeneración de heridas periodontales es rápida, el marco general de trabajo de formación de tejido (hueso , ligamento periodontal y tejido conectivo) se describe ampliamente en 14 días.

Shaw et al (2009) revisaron la reparación de heridas de un vistazo y describieron el complejo proceso de reparación de heridas. Hizo hincapié en que la remodelación de la matriz extracelular se logra mediante un delicado equilibrio de MMP.

Teles et al (2010) midieron los niveles de biomarcadores GCF y especies bacterianas subgingivales en sujetos periodontalmente sanos y con periodontitis. Concluyó que los sitios clínicamente sanos de sujetos con periodontitis presentan niveles más altos de biomarcadores GCF y patógenos periodontales que los sitios de sujetos sanos.

6.3 Objetivo del estudio: El objetivo principal de este estudio es evaluar el efecto y el impacto de CAF+SCTG para la cobertura radicular en sitios de recesión gingival clase I y II de Miller en los niveles de MMP-8 en GCF y suero.

El objetivo secundario es probar la utilidad del nivel inicial de MMP-8 para predecir los resultados del tratamiento evaluados categóricamente y correlacionarlo con el patrón de curación temprana de heridas después de CAF + SCTG para la cobertura de la raíz.

MATERIALES Y MÉTODOS:

7.1 Fuente de datos:

Los pacientes que visiten el Departamento de Periodoncia para pacientes ambulatorios del Krishnadevaraya College of Dental Sciences and Hospital y que cumplan los criterios de inclusión y exclusión serán evaluados y seleccionados para el estudio.

El diseño experimental consistirá en un total de 15 a 20 sitios que serán reclutados para el estudio según los criterios de inclusión y exclusión. Se informará a los pacientes sobre el procedimiento quirúrgico y los materiales utilizados para el estudio y se obtendrá el consentimiento informado de los pacientes.

7.2 Método de recogida de datos:

Tamaño de la muestra:

Este estudio prospectivo será un ensayo de control clínico comparativo simple ciego con 15-20 pacientes que tienen defectos de recesión de clase I y II de Miller en el arco maxilar anterior.

Técnica de muestreo

• Después de los exámenes de detección en la fase inicial, cada sujeto recibirá una sesión de instrucciones de higiene bucal, raspado y alisado radicular con raspadores ultrasónicos y curetas manuales.
• El tratamiento quirúrgico del defecto de recesión no se programará hasta que el paciente pueda demostrar un estándar adecuado de control de placa supragingival (puntuación de placa <20% O Leary 1972). Los parámetros clínicos mencionados a continuación se registrarán al milímetro más cercano utilizando una sonda UNC-15 (Universidad de Carolina del Norte -15 sonda periodontal -Hu Friedy, Chicago, IL, EE. UU.) y se fabricarán stents oclusales de medición para posicionar las sondas de medición con resina acrílica polimerizada en frío sobre un modelo colado obtenido a partir de una impresión de alginato. Se construirá de modo que cubra las superficies oclusales del diente que se está tratando y las superficies oclusales de al menos un diente en dirección mesial y distal. También se extenderá apicalmente sobre las superficies vestibular y lingual para cubrir el tercio coronal de los dientes. Se marcarán tres surcos en el stent en los sitios mesiobucal, mediobucal y distobucal como puntos de referencia15 para que la medición posquirúrgica se realice en la misma posición y angulación que las realizadas antes de la cirugía, es decir, las mediciones de referencia luego de 6 meses.
• La muestra GCF se recolectará del surco gingival del diente indicado para el procedimiento de recubrimiento radicular (control negativo) y de otro diente con encía clínicamente sana (control positivo). Las muestras se recogerán al inicio del estudio y en el seguimiento posquirúrgico posterior (cuarto día, séptimo día y 6 meses).

Mediciones clínicas:

La siguiente medición clínica se registrará al inicio del estudio y después de 6 meses.

1. Profundidad de recesión gingival (GRD), medida como la distancia entre la LAC y el margen gingival.17
2. Ancho de recesión gingival (GRW), medido como la distancia entre el margen gingival mesial y el margen gingival distal.17
3. Profundidad de sondaje (PD), medida como la distancia desde el margen gingival hasta la base del surco gingival.17
4. Clinical Attachment Level (CAL), medición desde la CEJ (unión cementoesmalte) hasta la base del surco gingival.17
5. Ancho coronal apical del tejido queratinizado (KTW) medido como la distancia desde la unión mucogingival hasta el margen gingival.17
6. Los índices de cicatrización de heridas (WHI, por sus siglas en inglés) se evaluarán los días 4 y 7 (Lien-Hui Huang, 2005)
7. Índice de placa (Sillness y Loe, 1964)
8. Índice gingival (Loe y Sillness, 1963)
9. Índice de sangrado gingival (Ainamo y Bay, 1975)

PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO:

• Antes de comenzar la cirugía, las superficies radiculares cercanas a la pérdida de inserción bucal se instrumentarán con Currettes Gracey Mini-Five y se terminará el tratamiento mecánico cuando se obtengan superficies radiculares lisas y duras.16
• Bajo anestesia local con clorhidrato de lidocaína al 2 % (Ligox al 2 %, Indoco Remedies Ltd, Goa, India) con una hoja n.º 15 BP (Bard Parker), se realizará una incisión submarginal en la cara bucal del diente tratado y se extenderá 3 mm. horizontalmente en la encía interdental mesial y distal. Se realizará una incisión intrasulcular en la cara bucal del diente afectado. Se seguirán dos incisiones de liberación oblicuas y divergentes, que se extienden más allá de la unión mucogingival.
• Se elevará un colgajo de espesor completo hasta la MGJ (unión mucogingival) utilizando un pequeño elevador de periostio. Posteriormente, se levantará un colgajo de espesor parcial más allá de la unión mucogingival para permitir un desplazamiento coronal pasivo del colgajo cubriendo completamente la UCA sin tensión.16
• El alisado radicular se realizará con una cureta afilada. Las papilas adyacentes al diente tratado se desepitelizarán para crear una superficie sangrante para un lecho receptor, donde se colocará SCTG.
• El sitio donante que consiste en un injerto de tejido conjuntivo palatino de 2 mm de espesor se recolectará desde el área del premolar hasta el primer molar utilizando la técnica de "trampilla".14 El injerto de tejido conectivo se asegurará en su posición con suturas absorbibles 4-0 en los sitios receptores.
• Los colgajos se estabilizarán con sutura de cabestrillo en posición coronal, seguida de sutura interrumpida en las incisiones liberadoras en dirección apico-coronal utilizando suturas reabsorbibles 4-014.
• Los sitios quirúrgicos se protegerán con un apósito periodontal sin eugenol. Las instrucciones posoperatorias consistirán en enjuague bucal con clorhexidina al 0,2% 3 veces al día durante 3 semanas e ibuprofeno 600 mg para el control del dolor durante tres días. 33
• Las suturas se retirarán 7 días después de la cirugía y después de esto, los pacientes serán reinstruidos en la limpieza mecánica de los dientes tratados con el uso de un cepillo de dientes suave.33
• El retiro y el refuerzo de las instrucciones de higiene bucal se realizarán cada 2 meses.

Muestreo de líquido crevicular gingival (GCF) y ELISA:

• Los sujetos se sentarán cómodamente en posición vertical en el sillón dental y el sitio seleccionado estará bien iluminado.
• Las muestras de GCF se recolectarán después del índice de placa, pero antes de cualquier otro registro clínico que pueda causar irritación del tejido y contaminación sanguínea de la muestra.19 Durante el seguimiento posquirúrgico del 4.° y 7.° día, se retirará suavemente el apósito periodontal y se tomarán muestras del GCF del surco gingival.
• Después de secar suavemente el área con una ráfaga de aire, se eliminará la placa supragingival sin tocar la encía marginal. Se aislará el área con rollos de algodón para evitar la contaminación con saliva y se recolectará el GCF insertando tiras de papel estándar (papel perio; oraflow Inc., Smithtown, NY, EE. UU.) en la grieta hasta que se sienta una leve resistencia durante 30 segundos.19
• El volumen de la muestra GCF se medirá en un aparato calibrado (Periotron 8000 Proflow Inc., Amityville, NY, EE. UU.) TM, después de lo cual las lecturas se convertirán a un volumen real (µl) por referencia a la curva estándar. Las tiras del sitio seleccionado se transferirán a microtubos centrífugos que contienen 200 (µl) de solución salina tamponada con fosfato.19

Muestreo de suero:

• Se recolectarán ocho mililitros (8 ml) de sangre de la fosa antecubital después de 12 horas de ayuno por la mañana utilizando aguja calibre 20 con jeringas de 2 ml y se trasladará inmediatamente al laboratorio.
• Se dejará coagular la muestra de sangre a temperatura ambiente durante una hora, se extraerá el suero de la sangre mediante centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos. La muestra de suero se transferirá inmediatamente a un vial de plástico y se almacenará a -800 °C hasta el momento del ensayo34 realizado con el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Resultado:

El resultado primario medido será:

• Niveles de MMP-8 en GCF y suero al inicio y posterior seguimiento posquirúrgico después del procedimiento CAF+SCTG (4.°, 7.° y 6.° mes).
• Análisis cuantitativo de las muestras de GCF al inicio y al 4.°, 7.° y 6.° mes de seguimiento posquirúrgico.
• Correlación de los valores de GCF y MMP-8 en suero al inicio y al 4.º, 7.º y 6 meses después de la cirugía de seguimiento.

El resultado secundario medido será:

1. Los índices de cicatrización de heridas (WHI) se evaluarán el 4.° y 7.° día
2. Profundidad de recesión gingival (GRD)
3. Ancho de recesión gingival (GRW)
4. Profundidad de sondeo (PD)
5. Nivel de apego clínico (CAL)
6. Anchura coronal apical del tejido queratinizado (KTW)
7. Índice de placa, índice gingival e índice de sangrado gingival

Todos los parámetros anteriores se correlacionarán con los niveles de MMP-8.

análisis estadístico

Los valores obtenidos se compararán entre el GCF y el suero mediante la prueba ANOVA. Las diferencias medias en diferentes intervalos de tiempo desde el valor de referencia se evaluarán mediante la prueba U de Mann-Whitney por separado. Un valor de 'p' de < 0,05 se considerará estadísticamente significativo.