Hodnocení antimikrobiální fotodynamické terapie jako doplněk parodontologické léčby u kuřáků

MATERIÁLY A METODY

Souhlas s vyhledáváním – Všichni pacienti obdrží podrobné informace o experimentu (cíle, přínosy, rizika a nepohodlí) v souladu s formulářem souhlasu v tomto výzkumu. Všechny postupy budou podléhat schválení Etické komise (CEP) zubní školy Ribeirão Preto (FORP), University of São Paulo (USP).

Výpočet velikosti vzorku - Velikost vzorku byla stanovena tak, aby poskytla 80% sílu pro rozpoznání významného rozdílu 1 mm (d) mezi skupinami s 95% intervalem spolehlivosti (a = 0,05) a standardní odchylkou (s) 1,0 mm. Vezmeme-li v úvahu změny v průměrné úrovni klinického připojení (CAL) jako primární výslednou proměnnou a [Za (1,96) + Zb (0,84)]2 = 7,84. Výpočet velikosti byl založen na následujícím vzorci: n = {2[(s)2/(d)2]} · (Za + Zb)2. Bylo tedy potřeba celkem 16 pacientů. Počet pacientů zařazených do této studie byl však 20, vezmeme-li v úvahu, že někteří pacienti mohli být ztraceni během sledování.

Experimentální design - Vybrané subjekty obdrží specifickou instruktáž o ústní hygieně a supragingivální škálování na všech zubech sedm dní před zahájením intervencí. Typ studie bude rozdělená ústa se dvěma páry kontralaterálních jednokořenových zubů s proximálními periodontálními místy s hloubkou sondy ≥ 5 mm pro klinické, mikrobiologické a imunologické hodnocení. Počítačový program vygeneruje tabulku náhodných čísel, přičemž každý z vybraných zubních párů obdrží následující ošetření: SRP nebo SRP + několik epizod aPDT. Klinické, imunologické a mikrobiologické parametry budou hodnoceny na začátku (před intervencí) a po ukončení nechirurgické parodontologické terapie. Parodontální klinická vyšetření (před a po zákroku) bude provádět jeden vyškolený a kalibrovaný vyšetřující, který nezná experimentální skupiny této studie. Zkoušející jsou také slepí, aby mohli studovat imunologické a mikrobiologické analýzy. Postupy SRP a použití protokolu aPDT by měl pro tyto účely provádět jiný vyškolený operátor.

U každého pacienta bude proveden otisk alginátem, aby byly získány modely zubních oblouků a vyvinuta vodicí destička na acetátu s referenčními drážkami pro standardizaci zavádění a sklonu počítačové periodontální sondy (Florida Probe System, Florida Probe Corporation, Gainesville, FL, USA). Index viditelného plaku u každého pacienta bude hodnocen dichotomicky (O'Leary et al., 1972) a určen procentem povrchu zubů s plakem. Na 6 místech každého zubu (mezio-bukální, bukální, distobukální, mesiolingvální, lingvální a disto-lingvální) budou hodnoceny klinické parodontální parametry: Hloubka sondy (mm), která bude měřena od okraje dásně ke dnu kapsy; relativní úroveň klinického připojení (mm), která bude měřena od vodítka okluzní dlahy ke dnu kapsy; Krvácení při sondování, hodnoceno dichotomicky (Ainamo, Bay, 1976), přítomnost krvácení je považována za pozitivní, pokud se objeví do 20 s po zavedení sondy pro měření hloubky sondy. Tyto klinické parametry a index plaku každého pacienta budou zaznamenávány na začátku (období před intervencí) a také +30 a +90 dní po nechirurgické periodontální terapii.

Kalibrace vyšetřujícího - Kappa index bude použit k vyhodnocení kalibrace vyšetřujícího pro sběr klinických parodontálních parametrů za účelem měření shody mezi vyšetřujícím. Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) pro diagnostická kritéria musí být přijatelná shoda indexu Kappa větší nebo rovna 0,85 (WHO, 1997). Tato úroveň shody bude použita pro kalibraci zkoušejícího v tomto projektu. Bude vybráno deset pacientů, alespoň dva páry kontralaterálních zubů s jednokořenovými zuby s hloubkou sondy ≥5 mm v proximálních místech. Každý pacient je skenován dvakrát pomocí počítačové periodontální sondy (Probe Corporation Florida, Gainesville, FL, USA) s 48hodinovým intervalem mezi prvním a druhým vyšetřením, aby se získala spolehlivost uvnitř vyšetřujícího, která bude měřena stanovením kappa. index.

Imunologická analýza - Na začátku a ve dnech +14, +30 a +90, po nechirurgické parodontální terapii budou odebrány vzorky GCF z vybraných zubů. Supragingivální plak tyto prvky budou odstraněny a místa budou jemně vysušena proudem vzduchu a následně izolována pomocí sterilních bavlněných smotků. Vzorky GCF se získávají z meziálních a distálních míst za použití proužků Periopaper (Oralflow Inc., Amityville, NY, USA). Proužky budou opatrně umístěny na okraj gingiválního sulku po dobu 30 sekund. Množství absorbované gingivální tekutiny bude stanoveno elektronickým měřičem vlhké hmoty Periotron (Oralflow Inc., Amityville, NY). Proužky se umístí do sterilních eppendorfových lahviček typu, který bude skladován při teplotě 80 °C pro pozdější kvantifikaci cytokinů (pg/ml) TNF-a, IL-lp a IL-10. Hladiny cytokinů se stanoví pomocí 3-plexní soupravy Millipore (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 100TM a systému Luminex (Luminex, MiraiBio, Alameda, CA, USA).

Analýza kotininu ve slinách - Kotinin je metabolit nikotinu, který umožňuje monitorování expozice pacienta nikotinu (McGuire et al., 1989). Hladiny kotininu budou na začátku identifikovány imunoenzymatickou analýzou (ELISA) (Salimetrics Inc., State College, PA, USA) za použití soupravy pro kvantitativní analýzu kotininu ve slinách podle pokynů výrobce.

Mikrobiologická analýza - Na začátku a ve dnech +30 a +90, po provedení nechirurgické parodontální terapie, budou odebrány vzorky subgingiválního plaku vybraných zubů v proximálních parodontálních kapsách (meziální a distální). V každém vzorku budou stanoveny počty 40 subgingiválních druhů pomocí metody šachovnicové hybridizace DNA-DNA (Birth et al., 2008). Pro odběr subgingiválního plaku budou místa izolována sterilními bavlněnými válečky a vysušena proudem vzduchu. Supragingivální plak bude opatrně odstraněn pomocí sterilní kyrety. Následně se k odběru subgingiválního plaku použije další sterilní kyreta, počínaje od nejhlubší části kapsy po koronální oblast. Vzorky budou transportovány ve sterilních Eppendorfových lahvičkách a zpracovány v laboratoři dentální molekulární diagnostiky Fakulty zubního lékařství v Ribeirão Preto-USP

Nechirurgická parodontální terapie - 7 dní před nechirurgickou parodontální terapií všichni pacienti provedou kompletní periapikální radiografické vyšetření celých úst. Budou seskupeni do programu ústní hygieny (OHP) podle konkrétních potřeb. V tomto programu pacienti dostanou instrukce pro efektivní tvorbu vlastního plaku, včetně informací o Bassově technice (Bass, 1954) a interproximálním čištění dentální nití a mezizubními kartáčky. Budou také vyzváni, aby si jednou denně čistili jazyk a dostali jeden prostředek na čištění zubů, který budou používat během celého experimentálního období (Colgate Total, Anakol Ind. Com. Ltda – Kolynos do Brasil – Colgate Palmolive Co., São Bernardo do Campo, SP, Brazílie). Po dokončení tohoto programu ústní hygieny budou pacienti podrobeni hodnocení klinických parodontálních parametrů popsaných výše a také jim budou na vybraných místech odebrány vzorky subgingiválního plaku a GCF (základní období – období před intervencí). Brzy poté, obdrží supragingivální škálování a leštění pomocí koronárních gumových pohárků ve všech zubech v dutině ústní.

Nechirurgická parodontologická terapie je zahájena 7 dní po provedení OHP a počátečním supragingiválním škálování. Ošetření bude provedeno odborníkem v parodontologii v intervalu 24 hodin škálováním (supragingivální a subgingivální) a hoblováním kořenů všech zubů s periodontálním onemocněním ručně (Curetas Gracey, Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA) a ultrazvukové nástroje. Přístrojové vybavení bude drženo kvadrant po kvadrantu, dokud nedojde k dostatečnému vyčištění plochy a ohoblování kořenů, které bude kontrolováno pomocí průzkumníka. Jednotlivci budou absolvovat profesionální čištění jednou za dva týdny až tři měsíce po ukončení nechirurgické parodontologické terapie. V rámci Čtrnáctidenní kontroly a hodnocení bude sledována spolupráce pacienta na studii ověřující stav ústní hygieny.

Statistická analýza - Bude kontrolována normalita a homoskedasticita dat. Meziskupinové a vnitroskupinové srovnání v různých časových intervalech bude dosaženo pomocí adekvátních parametrických nebo neparametrických testů. Pro všechny statistické analýzy se použije 5% hladina významnosti. Všechny výpočty jsou prováděny pomocí softwaru SPSS (SPSS, Chicago IL, EUA).