Valutazione della terapia fotodinamica antimicrobica in aggiunta al trattamento parodontale nei fumatori

MATERIALI E METODI

Consenso alla ricerca - Tutti i pazienti riceveranno informazioni dettagliate sull'esperimento (obiettivi, benefici, rischi e disagi) in conformità con un modulo di consenso in questa ricerca. Tutte le procedure saranno soggette all'approvazione del Comitato Etico (CEP) della Ribeirão Preto Dental School (FORP), Università di San Paolo (USP).

Calcolo della dimensione del campione - La dimensione del campione è stata determinata per fornire l'80% di potenza per riconoscere una differenza significativa di 1 mm (d) tra i gruppi con un intervallo di confidenza del 95% (a = 0,05) e deviazione standard (s) di 1,0 mm. Considerando i cambiamenti nel livello medio di attacco clinico (CAL) come variabile di esito primaria e [Za (1,96) + Zb (0,84)]2 = 7,84. Il calcolo delle dimensioni è stato basato sulla seguente formula: n = {2[(s)2/(d)2]} · (Za + Zb)2. Pertanto, sono stati richiesti un totale di 16 pazienti. Tuttavia, il numero di pazienti arruolati in questo studio era di 20, considerando che alcuni pazienti potrebbero essere persi durante il follow-up.

Disegno sperimentale - I soggetti selezionati riceveranno istruzioni specifiche sull'igiene orale e l'ablazione sopragengivale in tutti i denti, sette giorni prima dell'inizio degli interventi. Il tipo di studio sarà la bocca divisa con due paia di denti uni-radicolari controlaterali con siti parodontali prossimali che presentano una profondità di sondaggio ≥ 5 mm per la valutazione clinica, microbiologica e immunologica. Una tabella di numeri casuali verrà generata da un programma per computer, ciascuna delle coppie dentali selezionate riceverà i seguenti trattamenti: SRP o SRP + diversi episodi aPDT. I parametri clinici, immunologici e microbiologici saranno valutati al basale (pre-intervento) e dopo il completamento della terapia parodontale non chirurgica. Gli esami clinici parodontali (pre e post-intervento) saranno eseguiti da un unico esaminatore addestrato e calibrato, che non conosce i gruppi sperimentali di questo studio. Gli esaminatori sono anche ciechi per studiare le analisi immunologiche e microbiologiche. Le procedure SRP e l'uso del protocollo aPDT dovrebbero essere eseguiti da un altro operatore addestrato per questi scopi.

In ogni paziente verrà eseguita un'impronta con alginato per ottenere i modelli delle arcate dentarie e sviluppo di una placca guida su acetato con scanalature di riferimento per standardizzare l'inserimento e l'inclinazione della sonda parodontale computerizzata (Florida Probe System, Florida Probe Corporation, Gainesville, Florida, Stati Uniti). L'indice di placca visibile di ciascun paziente, sarà valutato in modo dicotomico (O'Leary et al., 1972) e determinato dalla percentuale di superfici dentali con placca. In 6 siti di ciascun dente (mesio-buccale, buccale, distobuccale, mesio-linguale, linguale e disto-linguale) verranno valutati i parametri parodontali clinici: Probing Depth (mm) che verrà misurata dal margine gengivale al fondo della tasca; Livello di attacco clinico relativo (mm) che verrà misurato dalla guida della placca occlusale al fondo della tasca; Sanguinamento al sondaggio, valutato dicotomicamente (Ainamo, Bay, 1976), la presenza di sanguinamento è considerata positiva quando si presenta entro 20 secondi dall'inserimento della sonda per la misurazione della profondità di sondaggio. Questi parametri clinici e l'indice di placca di ciascun paziente saranno registrati al basale (periodo pre-intervento) nonché +30 e +90 giorni dopo la terapia parodontale non chirurgica.

Calibrazione dell'esaminatore - L'indice Kappa verrà utilizzato per valutare la calibrazione dell'esaminatore per la raccolta di parametri parodontali clinici al fine di misurare l'accordo intra-esaminatore. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per i criteri diagnostici, l'indice accettabile di concordanza Kappa deve essere maggiore o uguale a 0,85 (WHO, 1997). Questo livello di accordo verrà utilizzato per la calibrazione dell'esaminatore in questo progetto. Saranno selezionati dieci pazienti, almeno due coppie di denti uni-radici controlaterali con profondità sonda ≥5 mm nei siti prossimali. Ogni paziente viene scansionato due volte utilizzando una sonda parodontale computerizzata (Probe Corporation Florida, Gainesville, FL, USA) con un intervallo di 48 ore tra il primo e il secondo esame al fine di ottenere l'affidabilità intra-esaminatore, che verrà misurata determinando il Kappa indice.

Analisi immunologica - Al basale e nei giorni +14, +30 e +90, dopo la terapia parodontale non chirurgica verranno raccolti campioni di GCF da denti selezionati. Dalla placca sopragengivale questi elementi verranno rimossi ei siti verranno asciugati delicatamente con getti d'aria e successivamente isolati utilizzando rulli di cotone sterili. I campioni GCF sono ottenuti dai siti mesiali e distali con l'uso di strisce Periopaper (Oralflow Inc., Amityville, NY, USA). Le strisce verranno accuratamente posizionate sul margine del solco gengivale per 30 secondi. La quantità di fluido gengivale assorbito sarà determinata da un misuratore elettronico di Periotron a massa umida (Oralflow Inc., Amityville, NY). Le strisce vengono poste in fiale eppendorf sterili del tipo che verrà conservato a una temperatura di 80°C per la successiva quantificazione delle citochine (pg/ml) TNF-α, IL-1β e IL-10. I livelli di citochine sono determinati utilizzando un kit 3-plex Millipore (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 100TM e il sistema Luminex (Luminex, MiraiBio, Alameda, CA, USA).

Analisi della cotinina salivare - La cotinina è un metabolita della nicotina che permette di monitorare l'esposizione del paziente alla nicotina (McGuire et al., 1989). I livelli di cotinina saranno identificati al basale mediante analisi immunoenzimatica (ELISA) (Salimetrics Inc., State College, PA, USA) utilizzando un kit per l'analisi quantitativa di cotinina nella saliva secondo le istruzioni del produttore.

Analisi microbiologiche - Al basale e nei giorni +30 e +90, dopo aver eseguito la terapia parodontale non chirurgica, verranno prelevati campioni di placca sottogengivale dei denti selezionati in corrispondenza delle tasche parodontali prossimali (mesiale e distale). I conteggi di 40 specie sottogengivali saranno determinati in ciascun campione utilizzando il metodo checkerboard DNA-DNA hybridization (Birth et al., 2008). Per la raccolta della placca sottogengivale, i siti saranno isolati con rulli di cotone sterili e asciugati con getti d'aria. La placca sopragengivale verrà rimossa con cura utilizzando una curette sterile. Successivamente si utilizza un'altra curette sterile per raccogliere la placca sottogengivale, partendo dalla porzione più profonda della tasca fino alla regione coronale. I campioni saranno trasportati in fiale Eppendorf sterili e processati nel Laboratorio di Diagnostica Molecolare Dentale della Facoltà di Odontoiatria di Ribeirão Preto-USP

Terapia parodontale non chirurgica - A 7 giorni prima della terapia parodontale non chirurgica tutti i pazienti verranno sottoposti ad un esame radiografico periapicale completo dell'intera bocca. Saranno raggruppati in un programma di igiene orale (OHP) in base alle esigenze specifiche. In questo programma i pazienti riceveranno istruzioni per un'auto-placca efficace, incluse informazioni sulla tecnica di Bass (Bass, 1954) e sulla pulizia interprossimale con filo interdentale e spazzolini interdentali. Saranno inoltre incoraggiati a lavarsi la lingua una volta al giorno e riceveranno un singolo dentifricio da utilizzare durante l'intero periodo sperimentale (Colgate Total, Anakol Ind. Com. Ltda - Kolynos do Brasil - Colgate Palmolive Co., São Bernardo do Campo, SP, Brasile). Dopo il completamento di questo programma di igiene orale, i pazienti saranno sottoposti alla valutazione dei parametri clinici parodontali precedentemente descritti, e verranno inoltre raccolti campioni di placca sottogengivale e GCF in siti selezionati (basale - periodo pre-intervento). Subito dopo, riceverà il ridimensionamento sopragengivale e la lucidatura con coppette di gomma coronarica in tutti i denti nella cavità orale.

La terapia parodontale non chirurgica viene iniziata 7 giorni dopo l'esecuzione dell'OHP e l'iniziale ablazione sopragengivale. Il trattamento sarà effettuato da uno specialista in parodontologia, ad un intervallo di 24 ore mediante ablazione (sopragengivale e sottogengivale) e levigatura radicolare di tutti i denti con malattia parodontale, utilizzando la mano (Curetas Gracey, Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA) e strumenti ad ultrasuoni. La strumentazione verrà tenuta quadrante per quadrante, fino ad adeguata pulizia della zona e levigatura radicolare, che verrà verificata con l'ausilio di un esploratore. Gli individui riceveranno una pulizia professionale bisettimanale fino a tre mesi dopo la fine della terapia parodontale non chirurgica. In Controllo e valutazione quindicinale verrà monitorata la collaborazione del paziente allo studio, verificando lo stato di igiene orale.

Analisi statistica - Verranno verificate la normalità e l'omoschedasticità dei dati. I confronti inter- e intra-gruppo in diversi intervalli di tempo saranno realizzati attraverso adeguati test parametrici o non parametrici. Per tutte le analisi statistiche verrà utilizzato un livello di significatività del 5%. Tutti i calcoli vengono eseguiti utilizzando il software SPSS (SPSS, Chicago IL, EUA).