Avaliação da terapia fotodinâmica antimicrobiana como adjuvante ao tratamento periodontal em fumantes

MATERIAIS E MÉTODOS

Consentimento para pesquisa - Todos os pacientes receberão informações detalhadas sobre o experimento (objetivos, benefícios, riscos e desconfortos) de acordo com o termo de consentimento desta pesquisa. Todos os procedimentos serão submetidos à aprovação do Comitê de Ética (CEP) da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP) da Universidade de São Paulo (USP).

Cálculo do tamanho da amostra - O tamanho da amostra foi determinado para fornecer 80% de poder para reconhecer uma diferença significativa de 1 mm (d) entre grupos com intervalo de confiança de 95% (a = 0,05) e desvio padrão (s) de 1,0 mm. Considerando as mudanças no nível clínico médio de inserção (CAL) como variável de resultado primário e [Za (1,96) + Zb (0,84)]2 = 7,84. O cálculo do tamanho foi baseado na seguinte fórmula: n = {2[(s)2/(d)2]} · (Za + Zb)2. Portanto, um total de 16 pacientes foram necessários. No entanto, o número de pacientes incluídos neste estudo foi de 20, considerando que alguns pacientes poderiam ser perdidos durante o seguimento.

Desenho Experimental - Os sujeitos selecionados receberão instrução específica de higiene bucal e raspagem supragengival em todos os dentes, sete dias antes do início das intervenções. O tipo de estudo será boca dividida com dois pares de dentes unirradiculares contralaterais com sítios periodontais proximais apresentando profundidade de sondagem ≥ 5 mm para avaliação clínica, microbiológica e imunológica. Uma tabela de números aleatórios será gerada por um programa de computador, cada um dos pares odontológicos selecionados receberá os seguintes tratamentos: SRP ou SRP + vários episódios de aPDT. Os parâmetros clínicos, imunológicos e microbiológicos serão avaliados no início (pré-intervenção) e após o término da terapia periodontal não cirúrgica. Os exames clínicos periodontais (pré e pós-intervenção) serão realizados por um único examinador treinado e calibrado, que desconhecia os grupos experimentais deste estudo. Os examinadores também são cegos para estudar as análises imunológicas e microbiológicas. Os procedimentos SRP e o uso do protocolo aPDT devem ser executados por outro operador treinado para esses fins.

Em cada paciente será realizada uma impressão com alginato para obtenção dos modelos das arcadas dentárias e desenvolvimento de uma placa guia em acetato com sulcos de referência para padronizar a inserção e inclinação da sonda periodontal computadorizada (Florida Probe System, Florida Probe Corporation, Gainesville, Flórida, EUA). O índice de placa visível de cada paciente, será avaliado dicotomicamente (O'Leary et al., 1972) e determinado pela porcentagem de superfícies dentárias com placa. Em 6 sítios de cada dente (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, lingual e disto-lingual) serão avaliados os parâmetros clínicos periodontais: Profundidade de Sondagem (mm) que será medida da margem gengival até o fundo da bolsa; Nível de Inserção Clínico relativo (mm) que será medido do guia da placa oclusal até o fundo da bolsa; Sangramento à sondagem, classificado dicotomicamente (Ainamo, Bay, 1976), a presença de sangramento é considerada positiva quando apresentada até 20s após a inserção da sonda para medição da profundidade de sondagem. Esses parâmetros clínicos e o índice de placa de cada paciente serão registrados no início (período pré-intervenção), bem como +30 e +90 dias após a terapia periodontal não cirúrgica.

Calibração do Examinador - O índice Kappa será utilizado para avaliar a calibração do examinador para coleta de parâmetros clínicos periodontais a fim de medir a concordância intra-examinador. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) para critérios diagnósticos, a concordância do índice Kappa aceitável deve ser maior ou igual a 0,85 (OMS, 1997). Este nível de concordância será utilizado para calibração do examinador neste projeto. Dez pacientes serão selecionados, pelo menos dois pares de dentes unirradiculares contralaterais com profundidade de sonda ≥5 mm nos locais proximais. Cada paciente é escaneado duas vezes com sonda periodontal computadorizada (Probe Corporation Florida, Gainesville, FL, EUA) com intervalo de 48 horas entre o primeiro e o segundo exame, a fim de obter a confiabilidade intraexaminador, que será medida pela determinação do Kappa índice.

Análise imunológica - No início e nos dias +14, +30 e +90, após a terapia periodontal não cirúrgica serão coletadas amostras GCF de dentes selecionados. A placa supragengival desses elementos será removida e os locais serão suavemente secos com jatos de ar e posteriormente isolados com rolos de algodão estéril. As amostras do GCF são obtidas dos locais mesial e distal com o uso de tiras Periopaper (Oralflow Inc., Amityville, NY, EUA). As tiras serão cuidadosamente colocadas na margem do sulco gengival por 30 segundos. A quantidade de fluido gengival absorvido será determinada por um medidor eletrônico de massa úmida Periotron (Oralflow Inc., Amityville, NY). As tiras são colocadas em frascos eppendorf estéreis do tipo que serão armazenados à temperatura de 80C para posterior quantificação das citocinas (pg/ml) TNF-α, IL-1β e IL-10. Os níveis de citocinas são determinados usando um kit 3-plex Millipore (Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA) 100TM e o sistema Luminex (Luminex, MiraiBio, Alameda, CA, EUA).

Análise da cotinina salivar - A cotinina é um metabólito da nicotina que permite monitorar a exposição do paciente à nicotina (McGuire et al., 1989). Os níveis de cotinina serão identificados no início do estudo por análise imunoenzimática (ELISA) (Salimetrics Inc., State College, PA, EUA) usando um kit para análise quantitativa de cotinina na saliva de acordo com as instruções do fabricante.

Análise Microbiológica - No início e nos dias +30 e +90, após a realização da terapia periodontal não cirúrgica, amostras de placa subgengival dos dentes selecionados serão coletadas nas bolsas periodontais proximais (mesial e distal). A contagem de 40 espécies subgengivais será determinada em cada amostra utilizando o método checkerboard DNA-DNA hybridization (Birth et al., 2008). Para a coleta da placa subgengival, os locais serão isolados com rolos de algodão estéril e secos com jatos de ar. A placa supragengival será removida cuidadosamente usando uma cureta estéril. A seguir, outra cureta estéril é utilizada para coletar a placa subgengival, partindo da porção mais profunda da bolsa até a região coronal. As amostras serão transportadas em frascos Eppendorf estéreis e processadas no Laboratório de Diagnóstico Molecular Dentário da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP

Terapia periodontal não cirúrgica - 7 dias antes da terapia periodontal não cirúrgica, todos os pacientes farão um exame radiográfico periapical completo de toda a boca. Eles serão agrupados em um programa de higiene bucal (POH) de acordo com as necessidades específicas. Neste programa, os pacientes receberão instruções para uma autoplaca eficaz, incluindo informações sobre a técnica de Bass (Bass, 1954) e limpeza interproximal com fio dental e escovas interdentais. Também serão incentivados a escovar a língua uma vez ao dia e receber um único dentifrício para ser usado durante todo o período experimental (Colgate Total, Anakol Ind. Com. Ltda - Kolynos do Brasil - Colgate Palmolive Co., São Bernardo do Campo, SP, Brasil). Após a conclusão deste programa de higiene bucal, os pacientes serão submetidos à avaliação dos parâmetros clínicos periodontais descritos anteriormente, e também serão coletadas amostras de placa subgengival e FGC em locais selecionados (linha de base - período pré-intervenção). Logo após, receberá raspagem supragengival e polimento com taças de borracha coronária em todos os dentes da cavidade oral.

A terapia periodontal não cirúrgica é iniciada 7 dias após a execução da OHP e raspagem supragengival inicial. O tratamento será feito por um especialista em Periodontia, com intervalo de 24 horas por raspagem (supragegival e subgengival) e alisamento radicular de todos os dentes com doença periodontal, com auxílio manual (Curetas Gracey, Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA) e ferramentas ultrassônicas. A instrumentação será realizada quadrante a quadrante, até a adequada limpeza da área e alisamento radicular, que será conferido com o auxílio de um explorador. Os indivíduos receberão limpeza profissional quinzenalmente até três meses após o término da terapia periodontal não cirúrgica. No controle e avaliação quinzenal, será monitorada a colaboração do paciente com o estudo, verificando o estado de higiene bucal.

Análise Estatística - Será verificada a normalidade e homocedasticidade dos dados. As comparações inter e intragrupos em diferentes intervalos de tempo serão realizadas por meio de testes paramétricos ou não paramétricos adequados. Para todas as análises estatísticas será utilizado um nível de significância de 5%. Todos os cálculos são realizados usando o software SPSS (SPSS, Chicago IL, EUA).