Ocena przeciwdrobnoustrojowej terapii fotodynamicznej jako uzupełnienia leczenia periodontologicznego u palaczy

MATERIAŁY I METODY

Zgoda na poszukiwanie - Wszyscy pacjenci otrzymają szczegółowe informacje o eksperymencie (celach, korzyściach, zagrożeniach i niedogodnościach) zgodnie z formularzem zgody w tym badaniu. Wszystkie procedury będą podlegały zatwierdzeniu przez Komisję Etyki (CEP) Ribeirão Preto Dental School (FORP), University of São Paulo (USP).

Obliczanie wielkości próbki — Wielkość próby została ustalona tak, aby zapewnić 80% mocy rozpoznania znaczącej różnicy 1 mm (d) między grupami z 95% przedziałem ufności (a = 0,05) i odchyleniem standardowym (s) równym 1,0 mm. Biorąc pod uwagę zmiany średniego klinicznego poziomu przyczepu (CAL) jako pierwszorzędową zmienną wyniku oraz [Za (1,96) + Zb (0,84)]2 = 7,84. Obliczenia wielkości oparto na następującym wzorze: n = {2[(s)2/(d)2]} · (Za + Zb)2. Dlatego potrzebnych było łącznie 16 pacjentów. Jednak liczba pacjentów włączonych do tego badania wynosiła 20, biorąc pod uwagę, że niektórzy pacjenci mogli zostać utraconi podczas obserwacji.

Projekt eksperymentalny - Wybrani pacjenci otrzymają szczegółowe instrukcje dotyczące higieny jamy ustnej i skaling naddziąsłowy wszystkich zębów, siedem dni przed rozpoczęciem interwencji. Rodzaj badania to rozszczepiona jama ustna z dwiema parami przeciwległych zębów jednokorzeniowych z proksymalnymi miejscami przyzębia z głębokością sondowania ≥ 5 mm do oceny klinicznej, mikrobiologicznej i immunologicznej. Tablica liczb losowych zostanie wygenerowana przez program komputerowy, każda z wybranych par stomatologicznych otrzyma następujące zabiegi: SRP lub SRP + kilka epizodów aPDT. Parametry kliniczne, immunologiczne i mikrobiologiczne zostaną ocenione na początku (przed interwencją) oraz po zakończeniu niechirurgicznego leczenia periodontologicznego. Kliniczne badania periodontologiczne (przed i po zabiegu) będą wykonywane przez jednego przeszkolonego i skalibrowanego lekarza, który nie zna grup eksperymentalnych tego badania. Egzaminatorzy są również ślepi na badanie analiz immunologicznych i mikrobiologicznych. Procedury SRP i użycie protokołu aPDT powinny być wykonywane przez innego przeszkolonego operatora do tych celów.

U każdego pacjenta zostanie wykonany wycisk alginianowy w celu uzyskania modeli łuków zębowych i opracowania płytki prowadzącej na octanie z rowkami referencyjnymi w celu ujednolicenia wprowadzania i nachylenia skomputeryzowanej sondy periodontologicznej (Florida Probe System, Florida Probe Corporation, Gainesville, Floryda, Stany Zjednoczone). Wskaźnik widocznej płytki nazębnej u każdego pacjenta będzie oceniany dychotomicznie (O'Leary i wsp., 1972) i określany na podstawie procentowego udziału powierzchni zębów z płytką nazębną. W 6 miejscach każdego zęba (mezjalno-policzkowa, policzkowa, przedpoliczkowa, mezjalno-językowa, językowa i dystalno-językowa) zostaną ocenione kliniczne parametry przyzębia: Głębokość sondowania (mm), która zostanie zmierzona od brzegu dziąsła do dna kieszonki; względny poziom przyczepu klinicznego (mm), który będzie mierzony od prowadnicy płytki okluzyjnej do dna kieszeni; Krwawienie podczas sondowania, oceniane dychotomicznie (Ainamo, Bay, 1976), obecność krwawienia uważa się za dodatnią, jeśli pojawi się w ciągu 20 sekund po wprowadzeniu sondy w celu pomiaru głębokości sondowania. Te parametry kliniczne i wskaźnik płytki nazębnej każdego pacjenta będą rejestrowane na początku badania (okres przed interwencją) oraz +30 i +90 dni po niechirurgicznym leczeniu periodontologicznym.

Kalibracja egzaminatora — wskaźnik Kappa zostanie wykorzystany do oceny kalibracji egzaminatora w celu zebrania klinicznych parametrów przyzębia w celu zmierzenia zgodności między badaczami. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dla kryteriów diagnostycznych akceptowalny wskaźnik zgodności Kappa musi być większy lub równy 0,85 (WHO, 1997). Ten poziom zgody zostanie użyty do kalibracji egzaminatora w tym projekcie. Wybranych zostanie dziesięciu pacjentów, co najmniej dwie pary przeciwległych zębów jednokorzeniowych z głębokością sondy ≥5 mm w miejscach proksymalnych. Każdy pacjent jest dwukrotnie skanowany komputerową sondą periodontologiczną (Probe Corporation Florida, Gainesville, FL, USA) z 48-godzinną przerwą między pierwszym a drugim badaniem w celu uzyskania wiarygodności wewnątrzbadającej, która będzie mierzona poprzez oznaczenie Kappa indeks.

Analiza immunologiczna - Na początku oraz w dniach +14, +30 i +90, po niechirurgicznym leczeniu periodontologicznym, zostaną pobrane próbki GCF z wybranych zębów. Naddziąsłowa płytka nazębna elementy te zostaną usunięte, a miejsca delikatnie osuszone strumieniami powietrza, a następnie odizolowane za pomocą sterylnych wacików. Próbki GCF pobiera się z miejsc mezjalnych i dystalnych za pomocą pasków Periopaper (Oralflow Inc., Amityville, NY, USA). Paski zostaną ostrożnie umieszczone na brzegu bruzdy dziąsłowej na 30 sekund. Ilość wchłoniętego płynu dziąsłowego zostanie określona za pomocą elektronicznego miernika masy mokrej Periotron (Oralflow Inc., Amityville, NY). Paski umieszcza się w sterylnych fiolkach typu Eppendorf, które będą przechowywane w temperaturze 80°C do późniejszego oznaczenia ilościowego cytokin (pg/ml) TNF-α, IL-1β i IL-10. Poziomy cytokin określa się za pomocą zestawu 3-plex Millipore (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 100TM i systemu Luminex (Luminex, MiraiBio, Alameda, CA, USA).

Analiza kotyniny w ślinie - Kotynina jest metabolitem nikotyny, który umożliwia monitorowanie narażenia pacjenta na nikotynę (McGuire i in., 1989). Poziomy kotyniny zostaną określone na początku badania za pomocą analizy immunoenzymatycznej (ELISA) (Salimetrics Inc., State College, PA, USA) przy użyciu zestawu do ilościowej analizy kotyniny w ślinie zgodnie z instrukcjami producenta.

Analiza mikrobiologiczna - Wyjściowo oraz w dniach +30 i +90, po wykonaniu niechirurgicznego leczenia periodontologicznego, zostaną pobrane próbki płytki poddziąsłowej wybranych zębów z proksymalnych kieszonek przyzębnych (mezjalnej i dystalnej). Liczba 40 gatunków poddziąsłowych zostanie określona w każdej próbce przy użyciu metody hybrydyzacji DNA-DNA w szachownicę (Birth et al., 2008). W celu pobrania płytki nazębnej poddziąsłowej miejsca zostaną odizolowane sterylnymi bawełnianymi wałeczkami i osuszone strumieniem powietrza. Naddziąsłowa płytka nazębna zostanie ostrożnie usunięta sterylną łyżeczką. Następnie kolejną sterylną łyżeczką zbiera się płytkę poddziąsłową, zaczynając od najgłębszej części kieszonki do obszaru koronowego. Próbki będą transportowane w sterylnych fiolkach Eppendorf i przetwarzane w Dental Molecular Diagnostics Laboratory of the School of Dentistry of Ribeirão Preto-USP

Niechirurgiczne leczenie periodontologiczne - Na 7 dni przed niechirurgicznym leczeniem periodontologicznym wszyscy pacjenci zostaną poddani pełnemu badaniu radiologicznemu całej jamy ustnej. Zostaną one pogrupowane w program higieny jamy ustnej (OHP) zgodnie z konkretnymi potrzebami. W ramach tego programu pacjenci otrzymają instrukcje skutecznego samoosadzania płytki nazębnej, w tym informacje o technice Bassa (Bass, 1954) oraz o czyszczeniu przestrzeni międzyzębowych nicią dentystyczną i szczoteczkami międzyzębowymi. Będą również zachęcani do szczotkowania języka raz dziennie i otrzymają jeden środek do czyszczenia zębów do stosowania przez cały okres eksperymentu (Colgate Total, Anakol Ind. Com. Ltda – Kolynos do Brasil – Colgate Palmolive Co., São Bernardo do Campo, SP, Brazylia). Po zakończeniu tego programu higieny jamy ustnej pacjenci zostaną poddani ocenie opisanych wcześniej parametrów klinicznych przyzębia, a także zostaną pobrane płytki poddziąsłowe i próbki GCF w wybranych miejscach (stan wyjściowy - okres przed interwencją). Niedługo potem otrzymam skaling naddziąsłowy i polerowanie z gumowymi panewkami wieńcowymi we wszystkich zębach w jamie ustnej.

Niechirurgiczne leczenie periodontologiczne rozpoczyna się po 7 dniach od wykonania OHP i wstępnego scalingu naddziąsłowego. Zabieg zostanie wykonany przez specjalistę w dziedzinie periodontologii, w odstępie 24 godzin poprzez skaling (nad- i poddziąsłowy) oraz wygładzanie korzeni wszystkich zębów z chorobą przyzębia, przy użyciu ręki (Curetas Gracey, Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA) i narzędzia ultradźwiękowe. Oprzyrządowanie będzie trzymane ćwiartka po ćwiartce, aż do odpowiedniego oczyszczenia terenu i wyrównania korzeni, co zostanie sprawdzone przy pomocy eksploratora. Osoby otrzymają profesjonalne czyszczenie co dwa tygodnie do trzech miesięcy po zakończeniu niechirurgicznej terapii periodontologicznej. W ramach dwutygodniowej kontroli i oceny monitorowana będzie współpraca pacjentów z badaniem, weryfikująca stan higieny jamy ustnej.

Analiza statystyczna - Sprawdzona zostanie normalność i homoskedastyczność danych. Porównania międzygrupowe i wewnątrzgrupowe w różnych przedziałach czasowych zostaną przeprowadzone za pomocą odpowiednich testów parametrycznych lub nieparametrycznych. We wszystkich analizach statystycznych zostanie zastosowany poziom istotności 5%. Wszystkie obliczenia są wykonywane przy użyciu oprogramowania SPSS (SPSS, Chicago IL, EUA).