Intervence životního stylu v přípravě na těhotenství (LIPP)

Specifický cíl 1: Prozkoumat fyziologický význam intervence životního stylu v přípravě na těhotenství (LIPP) na metabolismus matky a novorozence a adipozitu.

Úvod/Odůvodnění: Naše předběžné údaje ukazují, že kontrolovaný zásah do životního stylu vede k významnému úbytku hmotnosti, zlepšené citlivosti na inzulín, glukózové toleranci a sekreci inkretinů spolu se zdravějšími kardiovaskulárními výsledky a výsledky složení těla u dospělých s nadváhou a obezitou. Očekáváme, že načasování a implementace navrhované intervence v oblasti životního stylu přinese podobné zdravotní přínosy u žen s nadváhou/obezitou plánujících druhé těhotenství a povede k větší citlivosti na inzulín, snížené sekreci inzulínu a menšímu zánětu. Tato zlepšení povedou k zabránění nadměrné dostupnosti živin (glukózy a lipidů) v přispění k nadměrnému růstu plodu/tukové tkáni. Pracovní hypotéza pro tento cíl je, že na rozdíl od GWG, snížená inzulinová senzitivita před těhotenstvím u obézních matek odpovídá za největší klinický rozptyl v přírůstku tuku u kojence. Ačkoli klinicky očekáváme pokles hmotnosti a BMI ve skupině LIPP, zlepšení citlivosti na inzulín a metabolického profilu jsou klíčovými fyziologickými měřítky souvisejícími s primárním výsledkem snížení novorozenecké adipozity, a nikoli úbytkem hmotnosti jako takovým.

Důvodem je, že optimální doba pro zavedení zásahu do životního stylu, který účinně zlepšuje zdraví matky na fyziologické, buněčné a molekulární úrovni a vede k optimální adipozitě dítěte, je před těhotenstvím. U žen, které po porodu hubnou, dochází v následujícím těhotenství ke snížení novorozenecké porodní hmotnosti (především tukové tkáně), zatímco u žen, které přibývají na váze, dochází ke zvýšení novorozenecké porodní hmotnosti a adipozity. Předpokládáme, že metabolický stav matky před otěhotněním určuje obezogenní in-utero prostředí, které následně ovlivňuje placentární programování mitochondriálních a lipidových drah (Specifický cíl 2) a tělesné složení dítěte. Dalším zdůvodněním je, že je potřeba porozumět tomu, jak zlepšený pregravidní metabolický stav ovlivňuje fyziologické a molekulární funkce matky. Očekáváme, že obézní ženy, které absolvují program LIPP, vstoupí do těhotenství se zlepšeným metabolismem regulovaným inzulínem a sníženou inzulínovou rezistencí, což umožní nižší novorozeneckou porodní hmotnost a adipozitu. Přijmeme maminky, které porodily své první miminko v MHMC. Uvědomujeme si, že tyto matky představují demografickou skupinu, která má omezený přístup k cvičebním zařízením nebo systémům podpory rodiny, které by usnadnily volný čas na cvičení. Abychom omezili překážky v účasti, budeme cvičení provádět v místních komunitních rekreačních centrech. Centra mají zařízení péče o děti a my budeme podporovat náklady, aby si účastníci mohli přivést svá miminka na sezení LIPP. Abychom dále zvýšili účast a maximalizovali retenci, zajistíme dopravu do az rekreačních středisek. Podpora dopravy bude požadována od Cleveland Mt. Sinajská nadace. Životní styl Intervenční fáze hubnutí: Program LIPP je navržen tak, aby podporoval úbytek hmotnosti o 5–10 % tělesné hmotnosti. 4měsíční fáze hubnutí se skládá z aerobního cvičení s dietou a behaviorálním poradenstvím k navození hubnutí, jak bylo úspěšně dosaženo v předchozích studiích. Zpočátku bude cvičení pod dohledem předepsáno na 55–60 % HRmax a postupně zvyšováno tak, aby po 1–2 týdnech subjekty cvičily na 75–85 % HRmax (~65–70 % VO2max). Cvičení pod dohledem se bude skládat z chůze/joggingu na běžeckém pásu a stacionární jízdy na kole, 3 dny/týden, 60 min/sezení (tj. 500 kcal/sezení). Ženy budou během každého cvičení nosit monitory srdečního tepu (HR) (Polar Electro, Woodbury, NY), aby měly vizuální zpětnou vazbu o jejich personalizované cílové tepové frekvenci. Účastníkům bude doporučeno snížit kalorický příjem o ~500 kcal/den, aby podpořili své cíle v oblasti hubnutí. Doporučená strava poskytne ~ 55 % kalorií jako sacharidy, 25 % jako tuky a 20 % jako bílkoviny. Účastníci budou instruováni, aby konzumovali komplexní sacharidy a vyhýbali se jednoduchým cukrům. Specifická kalorická potřeba bude odhadnuta nepřímou kalorimetrií a korekčním faktorem pro sedavou (x1,3) fyzickou aktivitu. Energetický příjem bude odhadnut pomocí aplikace Food Photo Diary App Meal Snap. Digitální fotografie poskytuje vynikající odhad energetického příjmu (67). Účastníkům, kteří nevlastní chytrý telefon, bude jeden poskytnut prostřednictvím podpory Clevelandské nadace.

Záznamy pokrývající 72hodinovou dietu budou sdíleny s výzkumným týmem pro stanovení příjmu kalorií a živin. Meal Snap má databázi potravin s více než 350 000 položkami. Některá jídla však v této databázi nebudou, a proto naši Trenéři životního stylu zadají všechna snědená jídla do naší dietní databáze (NDSR, Minneapolis, MN), aby usnadnili analýzu příjmu kalorií a makro/mikroživin. Subjekty vygenerují fotografie před a po jídle, aby odhadly množství snědeného jídla. Údaje budou získávány na začátku a ve 2týdenních intervalech během počátečního 16týdenního období hubnutí pod dohledem.

Intervence životního stylu – Řízení/udržování hmotnosti: Program řízení hmotnosti před otěhotněním (fáze 2A, 2B a 2C) je navržen tak, aby usnadnil personalizované cíle hubnutí pomocí životního stylu, který zahrnuje cvičení, dietu a úpravu chování, a je částečně založen na zkouška Look AHEAD. Intervence zahrnuje koncept sady nástrojů, který pomáhá splnit cíle v oblasti hubnutí. Trenéři životního stylu poskytnou personalizovanou výuku fyzické aktivity/cvičení – 10 000 kroků/den a účastníci budou používat FitBit Flex (Fitbit.com), aby sledovali počet kroků a čas cvičení. Během první fáze udržování hmotnosti (2A) budou ženy navštěvovat 2 skupinová sezení pod dohledem/týden. Tato sezení zahrnují strukturované cvičení (např. Zumba, jazzercise, chůze s kočárkem), kontrolu dietních fotografií, kde bylo jídlo snězeno (doma nebo venku; zaznamenané v aplikaci pro chytré telefony) a behaviorální poradenství (s jejich koučem životního stylu). Účastníci budou vyzváni, aby jedli 1 200–1 500 kcal/d (~55 % sacharidů, 25 % tuků, 20 % bílkovin), pokud mají méně než 113 kg, nebo 1 500–1 800 kcal/d, pokud mají >113 kg. Dietní údaje budou analyzovány ve 4týdenních intervalech během období udržování hmotnosti. Důležité je, že pro minimalizaci zátěže subjektu a pro maximalizaci uchovávání a získávání dat bude Lifestyle Coach sledovat příjem kalorií pomocí fotografického deníku účastníka. Strategie chování k motivaci rozhodování o zdravém životním stylu budou zahrnovat: sebemonitorování (jídlo, aktivita a váha pomocí online zdrojů FitBit), stanovení cílů (kroky/den, hubnutí), kontrola stimulů (tj. společenské stravování, rychlé občerstvení, sezení vs. stání), řešení problémů (mít k dispozici svačiny, cvičení doma) a prevence relapsu (tj. dovolená, alkohol, rychlé občerstvení, sladkosti, problémová jídla, nutkavé stravování). Po 4 měsících a požadovaném úbytku hmotnosti se subjekty přesunou do fáze 2B. Během této fáze subjekty dodržují cíl cvičení 10 000 kroků/den, ale bude se od nich vyžadovat pouze 1 kontrolované sezení/týden. Pokud se subjektu nepodaří udržet úbytek hmotnosti, definovaný jako přírůstek hmotnosti o 3 % aktuální tělesné hmotnosti, účastníci se vrátí do fáze 2A, kde budou lépe kontrolovat váhu. Alternativně, pokud je úbytek hmotnosti udržován po 3 měsících, budou subjekty postupovat do fáze 2C až do následujícího těhotenství. Fáze 2C se neskládá ze cvičení pod dohledem. Nicméně subjekt a Lifestyle Coach budou každý týden telefonovat, aby zhodnotili pokrok, včetně údajů o cvičení Fitbit a dietě. Data naznačují, že programy pro regulaci hmotnosti poskytované telefonem jsou srovnatelné s klinicky dodávanými programy. Během hovorů bude účastníkům doporučeno, aby pokračovali ve cvičení s intenzitou a trváním předepsaným během fáze 2B. Budou jim poskytnuty knihy o jídle a cvičení specifické pro daný jazyk. Ty budou použity jako vodítko pro příjem kalorií a poskytnou další záznam o dodržování. Účastníci randomizovaní do kontrolní skupiny obdrží informace o dietě/úbytku hmotnosti po těhotenství od odborníka na výživu CRU na rozdíl od odborníka na výživu LIPP (HB), aby se snížila křížová kontaminace mezi skupinami. Řízení hmotnosti během těhotenství: Všechny LIPP a obvyklé pečovatelské/kontrolní skupiny budou sledovány jejich primárním porodníkem. Oddělení OB/GYN v MHMC nedávno revidovalo své klinické pokyny pro léčbu žen s nadváhou/obezitou na základě bulletinu ACOG z prosince 2015 (2). Všem ženám s nadváhou/obezitou bude na začátku těhotenství nabídnuto výživové poradenství od registrovaného dietologa z oddělení výživy MHMC s následnými návštěvami podle potřeby na podporu GWG v rámci doporučení IOM. Nutriční terapie zváží pregravidní BMI matky, etnické, kulturní a sociální faktory při individualizaci zdravého stravování. Elektronický zdravotní záznam (EPIC) obsahuje grafický nomogram GWG, takže GWG bude sledován při každé návštěvě. Všichni účastníci budou vyzváni ke zvýšení fyzické aktivity po dobu alespoň 30 minut/den (především chůze). Klinický management, jako je ultrazvuk k odhadu růstu plodu a sledování plodu, bude založeno na doporučeních ACOG. Kouč životního stylu bude i nadále sledovat pouze subjekty LIPP, jak je popsáno v udržovací fázi návrhu výzkumu.

Metabolická hodnocení: Metabolická hodnocení budou provedena na začátku (3 měsíce ? 2 týdny) po porodu. Následná hodnocení budou prováděna po 4 (+/-2 týdnech) a 12 měsících (+/-2 týdny) a poté každých 6 měsíců (+/-2 týdny) před otěhotněním až do maximálně 24 měsíců. Jakmile má subjekt datování těhotenství a životaschopnost potvrzenou ultrazvukem, metabolická hodnocení budou pokračovat ve 12.–16. a 32.–36. týdnu gestace.

Složení těla matky: Antropometrická měření budou zahrnovat výšku, váhu a obvod boků a pasu. Celkový tělesný tuk bude měřen celotělovou pletysmografií (Bod Pod; Cosmed, Řím, Itálie). Použijeme hydratační konstantu 76 % pro beztukovou hmotu během pozdního těhotenství.

Výdej energie v klidu: Rychlost metabolismu v klidu (RMR) bude stanovena po nočním hladovění pomocí metabolického vozíku Cosmed OMNIA (Cosmed, Řím Itálie) s baldachýnovým systémem. Budeme kontrolovat stravu poskytnutím standardizovaného energeticky vyváženého jídla večer před testem z CRU. Účastníci budou 30 minut relaxovat v tiché metabolické místnosti se slabým osvětlením, než získají 30minutové měření vydechovaného dechu. Bude odhadnut oxidační a neoxidační metabolismus glukózy a budou odebrány vzorky moči před a po měření za účelem výpočtu neproteinového RQ (NPRQ). Tato data budou použita ve spojení se Specifickým cílem 2 a budou korelována se změnou mitochondriální funkce během těhotenství.

Kapacita cvičení: Inkrementální stupňovaný test na běžeckém pásu bude proveden na začátku, ve 4. a 6. měsíci v obou skupinách. Spotřeba kyslíku (Jaeger OxyCon Pro/Delta System, Hoechberg, Německo), srdeční frekvence a hodnocení vnímané námahy budou prováděny tak, jak bylo popsáno dříve.

Citlivost na inzulín a y-buňky Funkce: 75g orální glukózový toleranční test (OGTT) bude použit k posouzení postprandiální glykémie, citlivosti na inzulín a sekrece. Po celonočním hladovění budou vzorky krve odebírány v 10minutových intervalech prvních 60 minut a poté ve 20minutových intervalech. Údaje o C-peptidu budou analyzovány za použití kombinovaného modelového přístupu, aby se zajistila prehepatální sekrece inzulínu, citlivost na inzulín, dispoziční index a vztah k kinetice inzulínu a Cpeptidu (73). Glukóza v plazmě bude měřena metodou glukózooxidázy (YSI; Yellow Springs, OH).

Inzulin bude testován RIA (Millipore, Billerica, MA). Diagnóza GDM bude provedena pomocí kritérií doporučených ACOG (74).

Odezvy enteroinsulární osy: Budou odebrány vzorky plazmy (s vhodnými přísadami) pro měření inkretinových hormonů (glukagonu podobný peptid-1 (GLP-1) a inzulinotropní polypeptid závislý na glukóze (GIP) a střevní peptidy související s nasycením (cholecystokinin (CCK)). a peptid YY (PYY). Měření budou prováděna za statických (lačno) a dynamických (stimulovaných glukózou) (10 min intervaly až 1 hodina).

Metabolické a zánětlivé biomarkery: Vzorky krve nalačno budou odebrány pro měření CBC, TSH, HbA1c, lipidového panelu a celkového množství volných mastných kyselin (FFA). Adipocytokiny (adiponektin, leptin, interleukin-6, interleukin-8, TNF-a a hsCRP) budou měřeny pomocí ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Všechny vzorky od každého subjektu budou uchovávány při -80 °C a po dokončení provedeny ve stejném testu, aby se snížila variabilita.

Dotazník kvality života: Zdravotní průzkum SF-36 bude použit na začátku, po 4 a 12 měsících a poté v 6měsíčních intervalech až do těhotenství, aby se zhodnotila kvalita života související se zdravím subjektu. Tyto údaje poskytnou obecnou míru fyzického a duševního zdraví prostřednictvím posouzení fyzického fungování, tělesné bolesti, omezení způsobených fyzickými, osobními nebo emocionálními problémy a pohody, energie/únavy a celkového vnímání zdraví. Během těhotenství bude dotazník podáván ve 12.-16. a 32.-36. týdnu.

Měření tukové hmoty u kojenců: Máme rozsáhlé zkušenosti s odhadováním tělesného složení u novorozenců a byli jsme jedním z prvních center, která pořídila Pea Pod (pediatrická vzduchová denzitometrie), která je umístěna v CRU vedle porodnice a porodnice. jednotka.

Inzulinová rezistence při narození: Při narození získáme pupečníkovou krev pro inzulin a glukózu pro odhad inzulinové rezistence pomocí HOMA. Plný lipidový profil, CRP a adipokiny IL-6 a leptin (výborný marker novorozenecké tukové hmoty) budou měřeny v pupečníkové krvi, jak je popsáno výše.

Očekávané výsledky, výzvy a alternativní přístupy:

Primárním výsledným měřítkem tohoto návrhu je nižší neonatální adipozita při narození ve skupině LIPP ve srovnání s: 1) kontrolní skupinou a 2) prvorozeným jedincem. Jako sekundární výsledek očekáváme, že před dalším těhotenstvím LIPP způsobí významné zlepšení (absolutní a procentuální změny) v hmotnosti matky a složení těla, a co je důležitější, zlepší citlivost na inzulín, funkci beta-buněk, inkretinovou odpověď na glukózu, lipidy a záněty. biomarkery ve srovnání s kontrolní skupinou. Očekáváme také sníženou inzulínovou rezistenci, lipidy v pupečníku a zánětlivé profily u dětí narozených LIPP ve srovnání s kontrolami.

Nábor je dobře známý problém pro úspěšnou implementaci a dokončení studií intervence v oblasti životního stylu. Nicméně vzhledem k nové strategii náboru popsané výše, našemu jedinečnému přístupu k populaci pacientů a našim rozsáhlým zkušenostem s metabolickým výzkumem v těhotenství neočekáváme, že by nábor představoval nepřekonatelnou výzvu. V prvních 4 letech přijmeme 200 subjektů a dokončíme všechna hodnocení matky/dítěte podle navrženého časového plánu. V případě potřeby přijmeme subjekty z Clevelandské kliniky a univerzitních nemocnic, obě přidružené k Case Western Reserve University (CWRU). Strategie uchovávání zahrnují bezplatnou dopravu na cvičební lekce, bezplatnou službu péče o děti během lekcí životního stylu a konzultace s Lifestyle Coach, aplikace pro mobilní telefony pro snížení zátěže subjektu při zadávání dat, pravidelné telefonní kontakty a finanční pobídky, včetně dětské autosedačky při dodání. .

Náš tým měl mimořádný úspěch v udržení těhotných žen v našich předchozích studiích metabolického výzkumu a intervenčních studií životního stylu u populace s nadváhou a obezitou (48,64). V současném návrhu jsou také zavedeny další strategie pro maximalizaci udržení a minimalizaci výpadků. Patří mezi ně telefonní hovory a e-maily od Lifestyle Coach za účelem přezkoumání a posílení dovedností řešení problémů a sebemonitorování, jak je popsáno pro účastníky Programu prevence diabetu. Zavedeme také buddy systém, kde se každý účastník stane kamarádem jiného účastníka, dva kamarádi mohou společně připravovat jídlo, cvičit spolu, sdílet problémy atd. Buddy systém podporuje pocit, že pobyt ve studiu je důležitý nejen pro zdraví jednotlivce, ale také pro kamaráda. Pokud subjekty v programu LIPP nesplňují svůj cílový cíl hubnutí, zavedeme strategii náhrady jídla s využitím zdrojů metabolické kuchyně CRU/CTSC s ohledem na kalorické a nutriční potřeby matky v závislosti na kojení. Ne všichni účastníci otěhotní. Protože primárním výsledkem je neonatální adipozita, subjekty, které neotěhotní, nebudou zahrnuty do primární analýzy, ale budou zahrnuty do sekundárních analýz týkajících se pregravidního metabolického zlepšení. Náborem žen s předchozím těhotenstvím se výrazně snižuje riziko neplodnosti. Očekáváme, že přibližně 20 % žen zažije spontánní potrat, ale bude jim umožněno pokračovat a obnovit svou předchozí účast v LIPP nebo kontrolní skupině. Předpokládáme, že přibližně 25 % pacientek před otěhotněním vypadne a dalších 15 % může vypadnout během těhotenství. Do každé větve zapíšeme 100 subjektů, abychom zohlednili nepravděpodobnou událost 40% vyřazení. Přijmeme-li ještě přísnější strategii, uvádíme, že statistická síla je k dispozici pouze pro 50 subjektů na skupinu jako nejhorší scénář. Pokud retence zaostává za projekcemi, přijmeme další subjekty v nemocnicích přidružených k MHMC a CWRU. Zaměstnanci CRU budou pomáhat při odběru pupečníkové krve a placenty při porodu a při provádění tělesných opatření hrachu. Pokud dojde k poruše zařízení Pea Pod, odhadneme složení těla pomocí novorozenecké antropometrie.

Ačkoli budou subjekty s LIPP nabádány, aby odložily druhé těhotenství, dokud nebudou v udržovací fázi programu, vyloučíme subjekty s LIPP pouze v případě, že otěhotní během prvních 4 měsíců fáze hubnutí. U kontrolních subjektů dojde k vyloučení, pokud subjekt otěhotní před 3 měsíci poporodní randomizační návštěvy CRU. Použití antikoncepce v této fázi je zařazovacím kritériem. Ne všechny subjekty LIPP otěhotní v podobných časech po 4měsíční intervenci na hubnutí. Nebudeme upravovat dobu mezi těhotenstvími mezi LIPP a kontrolními subjekty. Metabolický stav LIPP a kontrolního subjektu (tělesné složení, citlivost a odpověď na inzulín atd.) použijeme při posledním metabolickém hodnocení v CRU před otěhotněním jako jejich pregravidní nebo výchozí stav pro následující těhotenství. Protože se jedná o těhotenskou studii, mohou být přijaty pouze ženy. Účinek LIPP na potomky samce a samice však budeme posuzovat společně a nezávisle na základě pohlaví.

Statistický přístup:

Primárními analýzami specifického cíle 1a budou porovnání záměru k léčbě LIPP a kontrolní skupiny s ohledem na změny v citlivosti matky na inzulín, BMI a tukové hmotě. Porovnání budou provedena nejprve dvouvýběrovými t-testy při p=0,05. Pokud by byla ve skupinách rozpoznána jakákoli nerovnováha matoucích faktorů, lineární regresní modely, které obsahují významné rozdíly (např. GDM) se použije k provedení úprav kovariát. Na základě našich jednoročních studií po porodu (62,63) budeme mít 90% schopnost detekovat absolutní nebo kovariátově upravené zlepšení citlivosti na inzulín o 30% a 80% schopnost detekovat zlepšení již od 25 % v LIPP vs. Kontrolní skupina. Budou uvedeny odpovídající 95% intervaly spolehlivosti (95% CI) pro absolutní nebo kovariátně upravené rozdíly nebo procentuální zlepšení citlivosti na inzulín mezi skupinami. Směrodatnou odchylku (SD) změny BMI od randomizace do následného těhotenství odhadujeme na 5,1 kg/m2. Budeme mít 90% schopnost detekovat absolutní nebo kovariátně upravený rozdíl v BMI 2,6 kg/m2 a 80% sílu detekovat rozdíl 2,26 kg/m2 a 90% sílu detekovat absolutní nebo kovariátně upravený rozdíl v tuku hmotnost 5,9 kg a 80% síla k detekci rozdílu 5,1 kg mezi skupinami před druhým těhotenstvím. Primární analýzou pro specifický cíl 1b je porovnání záměru k léčbě LIPP oproti kontrolním novorozencům s ohledem na tukovou hmotu při narození. Srovnání bude provedeno pomocí dvouvýběrového t-testu při p=0,05. Bude provedena lineární regrese, která bude zahrnovat hmotnost (měření tělesného složení) prvního dítěte subjektu jako kovariát. Pokud by byla zjištěna jakákoli nerovnováha matoucích faktorů (například gestační věk) ve skupinách, budou použity lineární regresní modely k provedení kovariátní úpravy. Na základě našich předběžných údajů odhadujeme SD neonatální tukové hmoty mezi LIPP a kontrolní skupinou na maximálně 225 g. S alespoň 50 ženami v každé skupině (za předpokladu 50% vyřazení) bude mít t-test nebo lineární regrese 90% schopnost detekovat absolutní nebo kovariátně upravený rozdíl 146 g tukové hmoty mezi skupinami. Máme 80% sílu pro detekci absolutního nebo kovariátně upraveného rozdílu, který je malý, jako je 126 g tukové hmoty mezi skupinami. Bude uveden odpovídající 95% CI pro absolutní nebo kovariátně upravený rozdíl v novorozenecké tukové hmotě mezi skupinami. Pro sekundární analýzy použijeme stejný statistický přístup. Na základě našich předběžných údajů odhadujeme SD porodní hmotnosti na 700 g; s 50 novorozenci v každé skupině budeme mít 90% schopnost detekovat absolutní nebo kovariátně upravený rozdíl 455 g v porodní hmotnosti a 80% sílu detekovat 393 g rozdíl mezi skupinami. Další sekundární analýzy budou zahrnovat cytokiny z pupeční šňůry. Srovnání bude provedeno pomocí dvouvýběrového t-testu na hladině významnosti p=0,05; pokud však data nejsou normálně distribuována, použijí se Mann-Whitney U testy nebo log transformace. K provedení kovariátních úprav budou použity modely lineární regrese, včetně matoucích faktorů. Na základě námi publikovaných údajů (80) odhadujeme směrodatné odchylky pupečníkového IL-6 a CRP na 3,4 pg/ml a 7 900 ng/ml. S 50 ženami v každé skupině budeme mít 90% schopnost detekovat zlepšení hladin IL-6 a CRP o 50% a 42% a 80% schopnost detekovat zlepšení o 42% a 36%, v tomto pořadí.

Specifický cíl 2: Stanovit molekulární účinky, pomocí kterých může zásah do životního stylu zahájený před těhotenstvím zlepšit oxidaci a akumulaci mitochondriálních lipidů v placentách.

Úvod/Odůvodnění: Naše údaje naznačují, že u obézních žen je mitochondriální defekt v placentární tkáni přítomen na začátku těhotenství, což inhibuje kapacitu placenty pro oxidaci mastných kyselin a přesouvá mastné kyseliny do esterifikačních drah a akumulace lipidů, což potenciálně vede ke zvýšené dostupnosti živin pro plod a vyšší adipozita v termínu. Naše skupina ukázala, že další mitochondriální procesy, jako je transport cholesterolu a steroidogeneze, jsou narušeny v placentách obézních žen rezistentních na inzulín v termínu. Mitochondriální obsah placenty (stanovený pomocí mtDNA a aktivity citrátsyntázy) není ovlivněn obezitou matek a inzulinovou rezistencí v termínu, což naznačuje, že pozorované defekty funkce jsou způsobeny spíše změnami v mitochondriální aktivitě než v počtu. Předchozí dietní intervence zahájené během těhotenství nebyly schopny změnit placentární y-oxidaci nebo ukládání fetálního tuku, potenciálně proto, že intervence byla zahájena poté, co byla narušena placentární mitochondriální funkce. Předpokládáme, že LIPP zlepší placentární mitochondriální oxidaci mastných kyselin, která bude měřitelná v termínu a bude spojena s nižší esterifikací a akumulací mastných kyselin a novorozeneckou tukovou hmotu. Hypotézou je, že snížená citlivost na inzulín a zvýšené zánětlivé prostředí u obézních matek narušuje mitochondriální ?-oxidaci ve vyvíjející se placentě. Jsou to změny v metabolismu placenty začínající na počátku těhotenství, které vedou ke změně dodávky živin a zvýšenému ukládání tuku u plodu. Naše zdůvodnění je založeno na potřebě pochopit, jak změny v metabolismu lipidů placenty zprostředkovávají účinky zlepšeného pregravidního metabolismu na novorozeneckou adipozitu. Očekáváme, že placenty obézních žen v programu LIPP budou vykazovat zlepšenou oxidaci mastných kyselin a sníženou esterifikaci a akumulaci lipidů v termínu. Dále očekáváme, že tyto změny budou korelovat s nižším zánětem matky a inzulinovou rezistencí v časném těhotenství a nižší novorozeneckou adipozitou v termínu.

Očekávané výsledky a koncové body: Předpokládáme, že ve srovnání s kontrolní skupinou budou mít placenty žen v LIPP: 1) zvýšenou ?-oxidaci, 2) sníženou esterifikaci mastných kyselin, 3) nižší obsah lipidů, 4) zvýšenou aktivitu mitochondriálního CPT1B, enzym omezující rychlost v y-oxidaci a vyšší fosfor ACC, který, když je fosforylován, produkuje méně malonyl CoA, hlavního inhibičního regulátoru CPT1B, a 5) žádný rozdíl v mitochondriálním obsahu (měřeno pomocí mtDNA a aktivity citrátsyntázy) . Předpokládáme také, že mitochondriální y-oxidace a aktivita CPT1B budou negativně korelovat s markery zánětlivých cytokinů v séru matky v časném těhotenství a inzulinovou rezistencí a neonatální adipozitou.

Experimentální design: Cíle specifického cíle 2 dosáhneme měřením změn v placentární mitochondriální enzymové aktivitě a metabolismu lipidů u žen zařazených do kontrolní skupiny nebo LIPP skupiny popsaných ve specifickém cíli 1. Placentární tkáň bude odebrána při porodu od všech účastníků studie a zalité v parafínu nebo bleskově zmrazené v kapalném dusíku a uskladněné při -80 °C pro molekulární analýzu. U podskupiny žen rodících plánovaným císařským řezem (odhadujeme ~30 % našich účastnic nebo N=15-18/skupina) také odebereme čerstvou placentární tkáň pro testy aktivity metabolismu lipidů.

Metabolismus placentárních lipidů: Tyto testy jsou dobře zavedeny v laboratoři O'Tierney-Ginn. Oxidace mitochondriálních mastných kyselin (FAO) a esterifikace na testy celkových lipidů budou prováděny v placentárních explantátech, jak bylo popsáno dříve, s některými modifikacemi. Čerstvě izolované placentární explantáty budou inkubovány v přítomnosti 100 uM studeného palmitátu a 3H-palmitátu (Moravek Radiochemicals) po dobu 18 hodin. Na konci inkubační doby se shromáždí médium pro kvantifikaci rychlosti FAO detekcí 3H2O pomocí Hughesovy ekvilibrační metody v parní fázi. Esterifikace na celkové lipidy bude stanovena homogenizací ošetřených explantátů v acetonu čistoty pro HPLC a inkubací za míchání při teplotě místnosti přes noc. Alikvotní část lipidové suspenze acetonového extraktu se použije ke stanovení radioaktivního obsahu kapalinovým scintilačním počítáním. Rychlosti oxidace a esterifikace budou definovány jako nmol palmitátu/mg tkáně/hod.

Hodnocení placentárních mitochondrií: Mitochondrie budou izolovány ze zmrazené placentární tkáně, jak bylo popsáno dříve. Markery aktivity oxidace lipidů (CPT1B) a syntézy/esterifikace (fosfo-ACC) budou měřeny pomocí komerčně dostupných kitů (Cell Signaling, Abcam) v izolovaných mitochondriích ze všech vzorků. Markery mitochondriálního obsahu (aktivita mtDNA a citrátsyntázy) budou měřeny v celé placentární tkáni ve všech vzorcích, jak bylo popsáno dříve.

Akumulace lipidů v placentách: Celkový obsah lipidů v placentách bude měřen pomocí Folchovy metody.

Předpokládané výzvy a alternativy: 1) Budeme používat pouze placenty dodané plánovaným císařským řezem pro in vitro oxidační a esterifikační testy, abychom se vyhnuli změnám souvisejícím s porodem. V naší nemocnici je míra císařského řezu u obézních žen ~40%. Náš konzervativní odhad, že 40–50 % předčasně ukončí porod následovaný 30 % pacientek rodících císařským řezem, vede k N=15–18/skupinu. Na základě našich předběžných údajů nám to umožní adekvátně detekovat rozdíly v metabolismu placentárních lipidů v důsledku LIPP. Odebereme vzorky placenty od všech účastníků studie pro testy aktivity mitochondriálních enzymů, což nám poskytne další hodnocení metabolické aktivity u většího počtu účastníků. 2) Placentární mitochondriální oxidační kapacita mastných kyselin může být ovlivněna počtem mitochondrií, aktivitou oxidativní fosforylace a energetickou účinností (coupling). Posouzení kapacity mitochondriální oxidativní fosforylace nebo energetické účinnosti vyžaduje čerstvě izolované mitochondrie a/nebo živé buňky, což by pro náš návrh bylo příliš ambiciózní a nákladné vzhledem k nepředvídatelné povaze doručení a velkému počtu účastníků. Alternativně budeme měřit markery mitochondriálního obsahu a klíčové enzymy v metabolismu mitochondriálních lipidů ve všech vzorcích placenty, abychom vyhodnotili některé potenciální mechanismy, které jsou základem změn v oxidaci mastných kyselin placenty. Kromě toho mohou být zmrazené vzorky odebrané ze všech placent použity k měření enzymů zapojených do transportu elektronů (např. ATP syntázy) jako markeru mitochondriální oxidativní fosforylace.

Statistická analýza: Primárním cílem Cíle 2 je určit vliv intervence životního stylu před těhotenstvím na placentární mitochondriální oxidaci mastných kyselin v termínu. Předpokládáme, že placentární a-oxidace bude vyšší ve skupině LIPP. Provedeme analýzu záměru léčby pomocí dvouvzorkového t-testu nebo neparametrického Wilcoxonova rank-sumu testu k posouzení rozdílů mezi skupinami. Regresní analýza bude použita k posouzení asociace placentární y-oxidace a enzymové aktivity s hladinami zánětlivých cytokinů u matky a inzulinovou rezistencí v časném těhotenství, spolu s novorozeneckou tukovou hmotou s úpravou na gestační věk a pohlaví. Pro všechny proměnné budou vypočítány popisné statistiky, jako je průměr, medián a rozsah. Analýza síly a velikosti vzorku založená na našich předběžných údajích o mitochondriální β-oxidaci u obézních žen (38-14 nmol/mg/hod) ukázala, že velikost vzorku N=18/skupina dosahuje 80% síly k detekci rozdílu 25 % mezi skupiny pomocí dvouvýběrového t-testu s hladinou významnosti 0,05.