Изменение образа жизни при подготовке к беременности (LIPP)

Конкретная цель 1: изучить физиологическое значение вмешательства в образ жизни при подготовке к беременности (LIPP) для материнского и неонатального метаболизма и ожирения.

Введение/обоснование. Наши предварительные данные показывают, что контролируемое изменение образа жизни приводит к значительной потере веса, улучшению чувствительности к инсулину, толерантности к глюкозе и секреции инкретинов, а также к улучшению показателей сердечно-сосудистой системы и состава тела у взрослых с избыточным весом и ожирением. Мы ожидаем, что сроки и реализация предлагаемого вмешательства в образ жизни окажут аналогичные преимущества для здоровья женщин с избыточным весом/ожирением, планирующих вторую беременность, и приведут к большей чувствительности к инсулину, снижению секреции инсулина и уменьшению воспаления. Эти улучшения приведут к предотвращению того, что избыточная доступность питательных веществ (глюкозы и липидов) будет способствовать избыточному росту плода/ожирению. Рабочая гипотеза для этой цели состоит в том, что, в отличие от GWG, снижение чувствительности к инсулину до беременности у матерей с ожирением объясняет наибольшую клиническую вариабельность прироста жира у младенцев. Хотя клинически мы ожидаем снижения веса и ИМТ в группе LIPP, улучшение чувствительности к инсулину и метаболического профиля являются ключевыми физиологическими показателями, связанными с первичным результатом снижения неонатального ожирения, а не с потерей веса как таковой.

Обоснование заключается в том, что оптимальное время для осуществления вмешательства в образ жизни, которое эффективно улучшает здоровье матери на физиологическом, клеточном и молекулярном уровне и приводит к оптимальному ожирению у ребенка, — до беременности. Женщины, которые теряют вес после родов, испытывают снижение веса новорожденного при рождении (в первую очередь жировой ткани) при последующей беременности, тогда как женщины, которые набирают вес, испытывают увеличение веса новорожденного при рождении и ожирение. Мы предполагаем, что метаболическое состояние матери до беременности определяет ожирение внутриутробной среды, что, в свою очередь, влияет на плацентарное программирование митохондриальных и липидных путей (конкретная цель 2) и состав тела ребенка. Дополнительным обоснованием является необходимость понимания того, как улучшение метаболического состояния до беременности влияет на физиологические и молекулярные функции матери. Мы ожидаем, что женщины с ожирением, завершившие программу LIPP, войдут в беременность с улучшенным метаболизмом, регулируемым инсулином, и сниженной резистентностью к инсулину, что будет способствовать более низкой массе тела новорожденного при рождении и ожирению. Мы будем набирать матерей, родивших своего первого ребенка в MHMC. Мы понимаем, что эти матери представляют демографическую группу, которая имеет ограниченный доступ к тренажерным залам или системам поддержки семьи, которые могли бы предоставить им свободное время для занятий спортом. Чтобы уменьшить барьеры для участия, мы будем проводить занятия в местных общественных центрах отдыха. В центрах есть детские учреждения, и мы оплатим расходы, чтобы участники могли приходить со своими детьми на занятия LIPP. Чтобы еще больше увеличить количество участников и максимально увеличить удержание, мы обеспечим транспортировку в центры отдыха и обратно. Поддержка транспортировки будет запрошена у Cleveland Mt. Фонд Синай. Вмешательство в образ жизни Этап снижения веса: Программа LIPP предназначена для снижения веса на 5-10% от веса тела. 4-месячная фаза снижения веса состоит из аэробных упражнений с диетой и поведенческим консультированием, чтобы вызвать потерю веса, как это было успешно достигнуто в предыдущих исследованиях. Первоначально контролируемые упражнения назначаются при 55-60% максимальной ЧСС и постепенно увеличиваются так, чтобы через 1-2 недели испытуемые тренировались при 75-85% максимальной ЧСС (~ 65-70% VO2max). Упражнения под наблюдением будут состоять из ходьбы/бега на беговой дорожке и велотренировок, 3 дня в неделю по 60 минут за занятие (т. е. 500 ккал за занятие). Женщины будут носить мониторы сердечного ритма (HR) (Polar Electro, Woodbury, NY) во время каждой тренировки, чтобы они имели визуальную обратную связь с их персонализированной целевой частотой сердечных сокращений. Участникам будет рекомендовано снизить потребление калорий примерно на 500 ккал в день, чтобы поддержать их цели по снижению веса. Рекомендуемая диета будет обеспечивать ~ 55% калорий в виде углеводов, 25% в виде жиров и 20% в виде белков. Участники будут проинструктированы потреблять сложные углеводы и избегать простых сахаров. Конкретные потребности в калориях будут оцениваться с помощью непрямой калориметрии и поправочного коэффициента малоподвижного образа жизни (x1,3) физической активности. Потребление энергии будет оцениваться с помощью приложения для фотодневника еды Meal Snap. Цифровая фотография обеспечивает превосходную оценку потребления энергии (67). Участники, у которых нет смартфона, получат его при поддержке Фонда Кливленда.

Записи, охватывающие 72-часовой период диеты, будут переданы исследовательской группе для определения потребления калорий и питательных веществ. Meal Snap имеет базу данных продуктов питания, содержащую более 350 000 наименований. Тем не менее, некоторых блюд не будет в этой базе данных, поэтому наши тренеры по стилю жизни внесут все съеденные продукты в нашу базу данных диет (NDSR, Миннеаполис, Миннесота), чтобы упростить анализ калорий и потребления макро/микронутриентов. Субъекты будут создавать фотографии до и после еды, чтобы оценить количество съеденной пищи. Данные будут получены на исходном уровне и с 2-недельными интервалами в течение начального 16-недельного периода контролируемой потери веса.

Вмешательство в образ жизни — управление/поддержание веса: программа управления весом до беременности (этапы 2A, 2B и 2C) предназначена для достижения индивидуальных целей по снижению веса с использованием образа жизни, включающего физические упражнения, диету и модификацию поведения, и частично основана на испытание Look AHEAD. Мероприятие включает в себя набор инструментов для достижения целей по снижению веса. Тренеры по стилю жизни предоставят индивидуальные инструкции по физической активности/упражнениям — 10 000 шагов в день, а участники будут использовать FitBit Flex (Fitbit.com) для отслеживания количества шагов и времени упражнений. Во время первой фазы поддержания веса (2А) женщины посещают 2 групповых занятия под наблюдением в неделю. Эти сеансы включают в себя структурированные упражнения (например, зумба, джаз-эрзайз, прогулки с коляской), просмотр фотозаписей о питании, где еда была съедена (дома или в гостях; записано в приложении для смартфона), и поведенческие консультации (с тренером по стилю жизни). Участникам будет рекомендовано потреблять 1200-1500 ккал/сутки (~55% углеводов, 25% жиров, 20% белков), если они весят менее 113 кг, или 1500-1800 ккал/сутки, если >113 кг. Данные о рационе будут анализироваться с интервалом в 4 недели в течение периода поддержания веса. Важно отметить, что для минимизации нагрузки на испытуемых и максимального удержания и сбора данных тренер по стилю жизни будет отслеживать потребление калорий, используя фотодневник участника. Поведенческие стратегии для мотивации принятия решений о здоровом образе жизни будут включать: самоконтроль (питание, активность и вес с использованием онлайн-ресурсов FitBit), постановку целей (количество шагов в день, потеря веса), контроль стимулов (например, социальное питание, фаст-фуд, сидячие занятия). по сравнению со стоянием), решение проблем (перекусывайте, занимайтесь дома) и профилактика рецидивов (т. Через 4 месяца и желаемой потери веса испытуемые переходят к Фазе 2В. На этом этапе испытуемые поддерживают цель упражнений в 10 000 шагов в день, но должны будут посещать только 1 занятие под наблюдением в неделю. Если субъекту не удается поддерживать потерю веса, определяемую как увеличение веса на 3% от текущего веса тела, участники вернутся к Фазе 2А для более контролируемого контроля веса. В качестве альтернативы, если потеря веса сохраняется через 3 месяца, субъекты переходят к фазе 2C до следующей беременности. Фаза 2C состоит из тренировок без надзора. Тем не менее, субъект и тренер по стилю жизни будут еженедельно разговаривать по телефону, чтобы анализировать прогресс, включая данные об упражнениях Fitbit и диету. Данные свидетельствуют о том, что программы управления весом, проводимые по телефону, сопоставимы с клиническими программами. Во время звонков участникам будет рекомендовано продолжать упражнения с интенсивностью и продолжительностью, установленными на этапе 2B. Им будут предоставлены журналы питания и упражнений для конкретного языка. Они будут использоваться для управления потреблением калорий и обеспечат еще один отчет о соответствии. Участники, рандомизированные в контрольную группу, получат информацию о диете/потере веса после беременности от диетолога CRU, а не от диетолога LIPP (HB), чтобы уменьшить перекрестное загрязнение между группами. Управление массой тела во время беременности: Все группы LIPP и группы обычного ухода/контроля будут находиться под наблюдением своего основного акушера-гинеколога. Отделение акушерства и гинекологии MHMC недавно пересмотрело свои клинические рекомендации по ведению женщин с избыточным весом/ожирением на основе практического бюллетеня ACOG от декабря 2015 г. (2). Всем женщинам с избыточным весом/ожирением на ранних сроках беременности будет предложено консультирование по вопросам питания, проводимое зарегистрированным диетологом из отдела питания MHMC с последующими посещениями по мере необходимости для поддержки GWG в соответствии с рекомендациями IOM. Диетотерапия будет учитывать ИМТ матери до беременности, этнические, культурные и социальные факторы при индивидуализации здорового питания. Электронная медицинская карта (EPIC) включает графическую номограмму GWG, поэтому GWG будет контролироваться при каждом посещении. Всем испытуемым будет рекомендовано увеличить физическую активность как минимум на 30 минут в день (в основном ходьба). Клиническое ведение, такое как УЗИ для оценки роста плода и наблюдение за плодом, будет основываться на рекомендациях ACOG. Коуч по стилю жизни продолжит наблюдение только за субъектами LIPP, как описано на этапе поддержания плана исследования.

Метаболические оценки: Метаболические оценки будут проводиться на исходном уровне (3 месяца ? 2 недели) после родов. Последующие оценки будут проводиться через 4 (+/-2 недели) и 12 месяцев (+/-2 недели), а затем каждые 6 месяцев (+/-2 недели) до наступления беременности, максимум до 24 месяцев. После того, как срок беременности субъекта и жизнеспособность подтверждены ультразвуком, метаболические оценки будут продолжены на 12-16 и 32-36 неделях беременности.

Состав тела матери: антропометрические измерения будут включать рост, вес, окружность бедер и талии. Общее количество жира в организме будет измеряться с помощью плетизмографии всего тела (Bod Pod; Cosmed, Рим, Италия). Мы будем использовать константу гидратации 76% для безжировой массы на поздних сроках беременности.

Расход энергии в покое: скорость метаболизма в покое (RMR) будет определяться после ночного голодания с использованием метаболической тележки Cosmed OMNIA (Cosmed, Рим, Италия) с системой навеса. Мы будем контролировать диету, предоставив стандартизированную сбалансированную по энергии еду вечером перед тестом от CRU. Участники будут отдыхать в тихой метаболической комнате с низким освещением в течение 30 минут, прежде чем получить 30-минутную меру выдыхаемого воздуха. Будет оцениваться окислительный и неокислительный метаболизм глюкозы, а образцы мочи будут получены до и после измерения для расчета небелкового RQ (NPRQ). Эти данные будут использоваться в сочетании с Конкретной целью 2 и будут соотнесены с изменением функции митохондрий во время беременности.

Способность к физической нагрузке: тест на беговой дорожке с поэтапной градацией будет проводиться в исходные моменты, а также через 4 и 6 месяцев в обеих группах. Потребление кислорода (система Jaeger OxyCon Pro/Delta, Hoechberg, Германия), частота сердечных сокращений и оценка воспринимаемой нагрузки будут выполняться, как описано ранее.

Чувствительность к инсулину и ?-клетки Функция: для оценки постпрандиальной гликемии, а также чувствительности и секреции инсулина будет использоваться пероральный тест на толерантность к глюкозе (ПГТТ) с массой 75 г. После ночного голодания образцы крови будут браться с 10-минутными интервалами в течение первых 60 минут, а затем с 20-минутными интервалами. Данные по С-пептиду будут проанализированы с использованием комбинированного модельного подхода для определения скорости предпеченочной секреции инсулина, чувствительности к инсулину, индекса диспозиции и соотнесения кинетики инсулина и С-пептида (73). Уровень глюкозы в плазме будет измеряться методом глюкозооксидазы (YSI; Yellow Springs, OH).

Инсулин будет проанализирован с помощью RIA (Millipore, Billerica, MA). Диагноз ГСД ставится с использованием критериев, рекомендованных ACOG (74).

Реакции энтероинсулярной оси: образцы плазмы (с соответствующими добавками) будут получены для измерения инкретиновых гормонов (глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1) и глюкозозависимого инсулинотропного полипептида (ГИП), а также кишечных пептидов, связанных с насыщением (холецистокинин (ХЦК)). и пептид YY (PYY). Измерения будут проводиться в статических (натощак) и динамических (стимулированных глюкозой) условиях (от 10 минут до 1 часа).

Метаболические и воспалительные биомаркеры: будут получены образцы крови натощак для измерения общего анализа крови, ТТГ, HbA1c, панели липидов и общего количества свободных жирных кислот (СЖК). Адипоцитокины (адипонектин, лептин, интерлейкин-6, интерлейкин-8, TNF-γ и hsCRP) будут измерять с помощью ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Все образцы от каждого испытуемого будут храниться при температуре -80°C и по завершении анализироваться в одном и том же анализе, чтобы уменьшить вариабельность.

Опросник качества жизни: Опрос здоровья SF-36 будет использоваться на исходном уровне, через 4 и 12 месяцев, а затем с интервалами в 6 месяцев до беременности для оценки качества жизни субъекта, связанного со здоровьем. Эти данные обеспечат общую меру физического и психического здоровья посредством оценки физического функционирования, телесной боли, ограничений, связанных с физическими, личными или эмоциональными проблемами, а также самочувствия, энергии/усталости и общего восприятия здоровья. При беременности анкету будут вводить в 12-16 и 32-36 недель.

Измерение жировой массы у младенцев: у нас есть большой опыт в оценке состава тела у новорожденных, и мы были одним из первых центров, которые приобрели гороховый стручок (детская воздушная денситометрия), который находится в CRU рядом с родильным отделением и послеродовым отделением. единица.

Резистентность к инсулину при рождении: при рождении мы возьмем пуповинную кровь на инсулин и глюкозу, чтобы оценить резистентность к инсулину с помощью HOMA. Полный профиль липидов, CRP и адипокины IL-6 и лептин (прекрасный маркер неонатальной жировой массы) будут измеряться в пуповинной крови, как описано выше.

Ожидаемые результаты, проблемы и альтернативные подходы:

Первичным показателем результата этого предложения является более низкое неонатальное ожирение при рождении в группе LIPP по сравнению с: 1) контрольной группой и 2) с первенцем субъекта. В качестве вторичных результатов мы ожидаем, что до следующей беременности LIPP приведет к значительному улучшению (абсолютные и процентные изменения) массы тела и состава тела матери и, что более важно, к улучшению чувствительности к инсулину, функции бета-клеток, инкретинового ответа на глюкозу, липидов и воспалительных процессов. биомаркеров по сравнению с контрольной группой. Мы также ожидаем снижения резистентности к инсулину, липидов пуповины и воспалительных профилей у детей, рожденных с LIPP, по сравнению с контрольной группой.

Рекрутинг является общепризнанной проблемой для успешного внедрения и завершения испытаний по вмешательству в образ жизни. Однако, учитывая описанную выше новую стратегию набора, наш уникальный доступ к популяции пациентов и наш обширный опыт метаболических исследований во время беременности, мы не ожидаем, что набор будет представлять собой непреодолимую проблему. Мы наберем 200 субъектов в течение первых 4 лет и завершим все оценки матери и ребенка в соответствии с предложенным графиком. При необходимости мы будем набирать субъектов из Кливлендской клиники и университетских больниц, входящих в состав Университета Кейс Вестерн Резерв (CWRU). Стратегии удержания включают в себя бесплатный проезд на занятия, бесплатные услуги по уходу за детьми во время занятий по образу жизни и консультации с тренером по стилю жизни, приложения для мобильных телефонов, чтобы уменьшить нагрузку субъекта на ввод данных, регулярные телефонные контакты и финансовые стимулы, включая детское автокресло при родах. .

Наша команда добилась выдающихся успехов в удержании беременных женщин в наших предыдущих метаболических исследованиях и исследованиях изменения образа жизни среди населения с избыточным весом и ожирением (48,64). В текущем предложении также предусмотрены дополнительные стратегии для максимального удержания и минимизации отсева. К ним относятся телефонные звонки и электронные письма от тренера по стилю жизни, чтобы проверить и закрепить навыки решения проблем и самоконтроля, как описано для участников программы профилактики диабета. Мы также создадим систему напарников, в которой каждый участник становится напарником для другого участника, два напарника могут вместе готовить еду, вместе заниматься спортом, делиться проблемами и т. д. Система напарников способствует ощущению того, что пребывание в исследовании важно не только для здоровья человека, но и для здоровья напарника. Если испытуемые в программе LIPP не достигают поставленной цели по снижению веса, мы реализуем стратегию замены приема пищи, используя ресурсы метаболической кухни CRU/CTSC, уделяя внимание потребностям матери в калориях и питательных веществах в зависимости от грудного вскармливания. Не все участники забеременеют. Поскольку первичным исходом является неонатальное ожирение, субъекты, которые не забеременели, не будут включены в первичный анализ, но будут включены во вторичный анализ, касающийся улучшения метаболизма до беременности. При наборе женщин с предыдущей беременностью риск бесплодия значительно снижается. Мы ожидаем, что примерно у 20% женщин произойдет самопроизвольный аборт, но им будет разрешено продолжать и возобновлять свое предыдущее участие либо в LIPP, либо в контрольной группе. Мы ожидаем, что примерно 25% испытуемых выпадут из исследования до наступления беременности, а еще 15% могут выбыть из исследования во время беременности. Мы зарегистрируем 100 субъектов в каждой группе, чтобы учесть маловероятное событие 40% отсева. Приняв еще более строгую стратегию, мы сообщаем, что статистическая мощность доступна всего для 50 субъектов в группе, что является наихудшим сценарием. Если удержание отстает от прогнозов, мы будем набирать дополнительных субъектов в больницах, связанных с MHMC и CWRU. Персонал CRU поможет собрать пуповинную кровь и плаценту при родах и провести измерения тела с помощью Pea Pod. В случае неисправности оборудования Pea Pod мы оценим состав тела с помощью неонатальной антропометрии.

Хотя субъектам LIPP будет рекомендовано отложить вторую беременность до тех пор, пока они не перейдут на поддерживающую фазу программы, мы исключим субъектов LIPP только в том случае, если они забеременеют в течение первых 4 месяцев фазы потери веса. Для контрольных субъектов исключение произойдет, если субъект забеременеет до визита рандомизации CRU через 3 месяца после родов. Использование противозачаточных средств на этом этапе является критерием включения. Не все субъекты LIPP забеременеют в одно и то же время после 4-месячного вмешательства по снижению веса. Мы не будем корректировать время между беременностями между субъектами LIPP и Control. Мы будем использовать LIPP и контрольный метаболический статус субъекта (состав тела, чувствительность к инсулину и реакция и т. д.) при последней метаболической оценке в CRU перед тем, как забеременеть, в качестве их прегравидарного или исходного статуса для последующей беременности. Поскольку это исследование беременности, в него могут быть включены только женщины. Однако мы будем оценивать влияние LIPP на потомство мужского и женского пола, вместе и независимо, в зависимости от пола.

Статистический подход:

Первичный анализ в соответствии с Конкретной целью 1a будет представлять собой сравнение назначенных на лечение групп LIPP и контрольной группы в отношении изменений материнской чувствительности к инсулину, ИМТ и жировой массы. Сравнения будут выполняться сначала с двухвыборочными t-критериями при p = 0,05. В случае выявления любого дисбаланса смешанных факторов в группах модели линейной регрессии, включающие существенные различия (например, GDM) будет использоваться для выполнения ковариатных корректировок. Основываясь на наших 1-летних послеродовых наблюдениях (62, 63), мы будем иметь 90%-ную мощность для обнаружения абсолютного или скорректированного ковариантного улучшения чувствительности к инсулину на 30% и 80%-ную мощность для обнаружения улучшения всего лишь на 25%. % в LIPP по сравнению с Контрольная группа. Будут представлены соответствующие 95% доверительные интервалы (95% ДИ) для абсолютных или скорректированных ковариантных различий или процентных улучшений чувствительности к инсулину между группами. Мы оцениваем стандартное отклонение (SD) изменения ИМТ от рандомизации до последующей беременности в 5,1 кг/м2. Мы будем иметь мощность 90% для обнаружения абсолютной или с поправкой на ковариацию разницы в ИМТ 2,6 кг/м2 и мощность 80% для обнаружения разницы в 2,26 кг/м2 и мощность 90% для обнаружения абсолютной или скорректированной по ковариации разницы в жире. масса 5,9 кг и 80% мощность для выявления разницы в 5,1 кг между группами до второй беременности. Первичный анализ для конкретной цели 1b представляет собой сравнение предполагаемого лечения новорожденных с LIPP и контрольной группы в отношении жировой массы при рождении. Сравнение будет проводиться с использованием двухвыборочного t-теста при p = 0,05. Будет выполнена линейная регрессия, которая будет включать вес (показатели состава тела) первого ребенка субъекта в качестве ковариации. Если будет выявлен какой-либо дисбаланс смешанных факторов (например, гестационного возраста) в группах, модели линейной регрессии будут использоваться для выполнения ковариантной корректировки. Основываясь на наших предварительных данных, мы оцениваем SD неонатальной жировой массы между группами LIPP и Control не более 225 г. При наличии не менее 50 женщин в каждой группе (при условии отсева 50%) t-критерий или линейная регрессия будут иметь мощность 90% для обнаружения абсолютной или ковариантной разницы в 146 г жировой массы между группами. У нас есть 80% мощности, чтобы обнаружить абсолютную или скорректированную по коварианту разницу в жировой массе всего 126 г между группами. Будет сообщен соответствующий 95% ДИ для абсолютной или ковариантной разницы массы жира новорожденного между группами. Для вторичного анализа мы будем использовать тот же статистический подход. Основываясь на наших предварительных данных, мы оцениваем стандартное отклонение массы тела при рождении в 700 г; с 50 новорожденными в каждой группе мы будем иметь 90% мощности для обнаружения абсолютной или ковариантной разницы в массе тела при рождении 455 г и 80% мощности для обнаружения разницы в 393 г между группами. Дополнительные вторичные анализы будут включать цитокины пуповины. Сравнения будут выполняться с использованием двухвыборочного t-критерия при уровне значимости p = 0,05; однако U-критерии Манна-Уитни или логарифмические преобразования будут использоваться, если данные не распределены нормально. Модели линейной регрессии, включая искажающие факторы, будут использоваться для выполнения ковариатных корректировок. Основываясь на наших опубликованных данных (80), мы оцениваем стандартные отклонения IL-6 и CRP в пуповине как 3,4 пг/мл и 7900 нг/мл соответственно. С 50 женщинами в каждой группе у нас будет 90%-я мощность, чтобы обнаружить улучшение уровней IL-6 и CRP на 50% и 42%, и 80%-я мощность, чтобы обнаружить улучшение на 42% и 36%, соответственно.

Конкретная цель 2: определить молекулярные эффекты, посредством которых изменение образа жизни, начатое до беременности, может улучшить окисление и накопление митохондриальных липидов в плаценте.

Введение/обоснование. Наши данные свидетельствуют о том, что у женщин с ожирением на ранних сроках беременности присутствует митохондриальный дефект в ткани плаценты, который подавляет способность плаценты к окислению жирных кислот и переводу жирных кислот в пути этерификации и накоплению липидов, что может привести к увеличению доступности питательных веществ для плода и повышенное ожирение в срок. Наша группа показала, что другие митохондриальные процессы, такие как транспорт холестерина и стероидогенез, нарушены в плацентах женщин с ожирением и резистентностью к инсулину в срок. Содержание митохондрий в плаценте (оцененное по активности мтДНК и цитрат-синтазы) не зависит от ожирения матери и резистентности к инсулину в срок, что позволяет предположить, что наблюдаемые дефекты функции связаны с изменениями активности митохондрий, а не их количества. Предыдущие диетические вмешательства, начатые во время беременности, не смогли изменить β-окисление плаценты или отложение жира у плода, возможно, потому, что вмешательство было начато после нарушения функции митохондрий плаценты. Мы ожидаем, что LIPP улучшит плацентарное окисление митохондриальных жирных кислот, которое будет поддаваться измерению в доношенный срок и будет связано с более низкой этерификацией и накоплением жирных кислот, а также массой жира у новорожденных. Гипотеза состоит в том, что сниженная чувствительность к инсулину и повышенная воспалительная среда у матерей с ожирением ухудшают митохондриальное β-окисление в развивающейся плаценте. Именно изменения в плацентарном метаболизме, начинающиеся на ранних сроках беременности, приводят к нарушению доставки питательных веществ и увеличению отложения жира у плода. Наше обоснование основано на необходимости понять, как изменения в липидном метаболизме плаценты опосредуют влияние улучшенного прегравидарного метаболизма на неонатальное ожирение. Мы ожидаем, что плаценты женщин с ожирением в программе LIPP продемонстрируют улучшение окисления жирных кислот и снижение этерификации и накопления липидов в срок. Кроме того, мы ожидаем, что эти изменения будут коррелировать со снижением материнского воспаления и резистентности к инсулину на ранних сроках беременности и снижением ожирения новорожденных в срок.

Ожидаемые результаты и конечные точки. Мы ожидаем, что по сравнению с контрольной группой плаценты женщин с LIPP будут иметь: 1) повышенное β-окисление, 2) сниженную этерификацию жирных кислот, 3) более низкое содержание липидов, 4) повышенную активность митохондриального CPT1B, фермент, ограничивающий скорость β-окисления, и более высокий уровень фосфора ACC, который при фосфорилировании продуцирует меньше малонил-КоА, основного ингибирующего регулятора CPT1B, и 5) отсутствие различий в содержании митохондрий (согласно измерению активности мтДНК и цитратсинтазы) . Мы также ожидаем, что митохондриальное β-окисление и активность CPT1B будут отрицательно коррелировать с маркерами воспалительных цитокинов в материнской сыворотке на ранних сроках беременности, инсулинорезистентностью и неонатальным ожирением.

План эксперимента. Мы достигнем целей Конкретной цели 2 путем измерения изменений активности плацентарных митохондриальных ферментов и метаболизма липидов у женщин, включенных в контрольную группу или группу LIPP, описанных в Конкретной цели 1. Ткань плаценты будет собрана при родах у всех участников исследования и заливают в парафин или быстро замораживают в жидком азоте и хранят при температуре -80°C для молекулярного анализа. У подмножества женщин, родивших путем планового кесарева сечения (по нашим оценкам, около 30% наших участников или N = 15-18 в группе), мы также соберем свежую плацентарную ткань для анализа активности липидного обмена.

Метаболизм липидов плаценты: эти анализы хорошо зарекомендовали себя в лаборатории O'Tierney-Ginn. Окисление митохондриальных жирных кислот (FAO) и этерификация в общие анализы липидов будут выполняться в эксплантатах плаценты, как описано ранее, с некоторыми изменениями. Свежевыделенные эксплантаты плаценты инкубируют в присутствии 100 мкМ холодного пальмитата и 3Н-пальмитата (Moravek Radiochemicals) в течение 18 часов. В конце инкубационного периода собирают среду для количественного определения скорости FAO путем обнаружения 3H2O с использованием метода уравновешивания паровой фазы Хьюза. Этерификация до общих липидов будет определяться путем гомогенизации обработанных эксплантов в ацетоне для ВЭЖХ и инкубации при перемешивании при комнатной температуре в течение ночи. Аликвоту липидной суспензии ацетонового экстракта используют для определения радиоактивного содержания методом жидкостного сцинтилляционного счета. Скорости окисления и этерификации будут определяться как нмоль пальмитата/мг ткани/час.

Оценка плацентарных митохондрий: Митохондрии будут выделены из замороженной плацентарной ткани, как описано ранее. Маркеры активности окисления липидов (CPT1B) и активности синтеза/этерификации (фосфо-ACC) будут измеряться с использованием имеющихся в продаже наборов (Cell Signaling, Abcam) в изолированных митохондриях из всех образцов. Маркеры митохондриального содержания (мтДНК и активность цитратсинтазы) будут измеряться во всех образцах цельной плацентарной ткани, как описано ранее.

Накопление плацентарных липидов: Общее содержание плацентарных липидов будет измеряться с использованием метода Фолча.

Предполагаемые проблемы и альтернативы: 1) Мы будем использовать только плаценты, доставленные путем планового кесарева сечения, для тестов на окисление и этерификацию in vitro, чтобы избежать изменений, связанных с родами. В нашей больнице частота кесарева сечения у женщин с ожирением составляет около 40%. По нашей консервативной оценке 40-50% выбывших женщин, за которыми следуют 30% женщин, родивших с помощью кесарева сечения, дают N=15-18/группу. Основываясь на наших предварительных данных, это даст нам достаточно возможностей для обнаружения различий в липидном метаболизме плаценты из-за LIPP. Мы соберем образцы плаценты у всех участников исследования для анализа активности митохондриальных ферментов, что даст нам дополнительную оценку метаболической активности у большего числа участников. 2) Способность плацентарных митохондрий к окислению жирных кислот может зависеть от числа митохондрий, активности окислительного фосфорилирования и энергетической эффективности (связывания). Оценка способности митохондриального окислительного фосфорилирования или энергетической эффективности требует свежевыделенных митохондрий и/или живых клеток, что для нашего предложения было бы чрезмерно амбициозным и дорогостоящим, учитывая непредсказуемый характер доставки и большое количество участников. В качестве альтернативы мы будем измерять маркеры митохондриального содержимого и ключевые ферменты митохондриального метаболизма липидов во всех образцах плаценты, чтобы оценить некоторые потенциальные механизмы, лежащие в основе изменений в окислении плацентарных жирных кислот. Кроме того, замороженные образцы, собранные из всех плацент, можно использовать для измерения ферментов, участвующих в переносе электронов (например, АТФ-синтазы) в качестве маркера митохондриального окислительного фосфорилирования.

Статистический анализ. Основная цель Цели 2 – определить влияние изменения образа жизни до беременности на окисление плацентарных митохондриальных жирных кислот в срок. Мы предполагаем, что плацентарное β-окисление будет выше в группе LIPP. Мы проведем анализ намерения лечить с использованием двухвыборочного t-критерия или непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона для оценки различий между группами. Регрессионный анализ будет использоваться для оценки связи плацентарного β-окисления и активности ферментов с уровнями воспалительных цитокинов у матери и резистентностью к инсулину на ранних сроках беременности, а также с массой жира новорожденного с поправкой на гестационный возраст и пол. Описательная статистика, такая как среднее значение, медиана и диапазон, будет рассчитана для всех переменных. Анализ мощности и размера выборки, основанный на наших предварительных данных митохондриального β-окисления у женщин с ожирением (38–14 нмоль/мг/ч), показал, что размер выборки N=18/группа достигает 80% мощности для обнаружения разницы в 25% между группы с использованием двухвыборочного t-критерия с уровнем значимости 0,05.