Vyplachování folikulů versus přímá aspirace

Půjde o prospektivní pozorovací párovou studii o vlivu rychlosti obnovy oocytů z folikulárního zarudnutí, zralosti oocytů, rychlosti oplodnění a vývoje a využití embrya ve srovnání s přímou aspirací (bez zarudnutí) u žen podstupujících léčbu IVF.

U každé zařazené ženy bude náhodně přiřazen jeden vaječník (pravý nebo levý), který bude aspirován buď folikulárním proplachem, nebo přímou aspirací bez proplachu. Primárním koncovým bodem bude míra obnovy oocytů (oocyty získané na jeden odsátý folikul). Sekundárními výstupy budou zralost oocytů, rychlost oplodnění a vývoj a využití embrya. Míra těhotenství bude hlášena jako náhradní výsledek.

TRANSVAGINÁLNÍ ODBĚR OCYTŮ

Po řízené ovariální stimulaci (COS) je pomocí hCG nebo triptorelinu spuštěno konečné zrání oocytů. Odběr oocytů se provádí 35-36 hodin po spuštění. Postup zahrnuje transvaginální ultrazvukem řízenou aspiraci folikulů pomocí aspirační jehly s dvojitým lumenem (16G, Casmed). Pro výkon je nutný interdisciplinární tým zahrnující gynekology, embryology, porodní asistentky/sestry a anesteziology. Provádí se na gynekologickém operačním sále v sousedství embryologické laboratoře, pacientka je pod sedativy a za aseptických podmínek a přísné regulace podmínek prostředí, aby byla zajištěna životaschopnost oocytů a bezpečnost pacientky.

Před výkonem Den před výkonem embryolog připraví kultivační misky (Misky Falcon Central Well) obsahující bikarbonátové pufrované médium speciálně určené pro kultivaci oocytů (Fert, Origio) překryté minerálním olejem (Fertipro). Misky se umístí do inkubátoru s 5-7% C02 při 37 °C, aby se přes noc ustálily. Alikvoty HEPES pufrovaného média (Flushing medium, Origio), které dosahují regulace pH mimo inkubátor, se předehřejí na 37oC. Nakonec se do inkubátoru divadla umístí 160ml baňky s DPBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfátem) pro použití při proplachování folikulů k předehřátí. Veškerá embryologická příprava se provádí asepticky pod digestoří s laminárním prouděním.

Procedura využívá chirurgické zařízení, které je autoklávováno a baleno do sterilních chirurgických hadříků. Všechny materiály, které přicházejí do styku s folikulární tekutinou, jako jsou oocytové jehly, 20ml injekční stříkačky (netoxické, BD) a odběrové zkumavky (14ml IVF zkumavky, NUNC), jsou IVF testovány pomocí MEA testování (přežití myších blastocyst), předsterilizovány a jedno použití. Ty se před použitím skladují v ohřívací komoře na 37 °C.

Používáme jehlu s dvojitým lumenem 16G (Casmed, UK), která umožňuje kontinuální odsávání a proplachování folikulů. Jehla má délku 30 cm a echogenní značky v blízkosti špičky pro snadné rozpoznání pod transvaginálním ultrazvukovým vedením. Délka hadičky je 60 cm a obsahuje zátku pro připojení ke standardní zkumavce a samostatnou hadičku s Luer-lockem pro připojení k injekční stříkačce pro proplachování. Jehla a její spoje jsou vyrobeny z vysoce kvalitní chirurgické nerezové oceli. Hadička je vyrobena z průsvitného PTFE (polytetrafluorethylenu).

Všechny produkty jsou vyráběny v souladu s normami kvality ISO 9001:2008, ISO 13485 a označením CE.

Příprava na výkon Příprava pacienta Před vstupem na operační sál anesteziolog potvrdí anamnézu pacientky související s její bezprostřední anestezií.

Pacientka je doprovázena na operační sál a její totožnost je potvrzena dvěma osobami, které podepisují svědeckou listinu. U pacientek s velmi malým počtem očekávaných oocytů (slabé odpovědi, mírné IVF nebo přirozené cykly) ošetřující lékař těsně před výkonem provede transvaginální ultrazvuk, aby se potvrdila přítomnost a umístění zralých folikulů. V případech vysokého rizika syndromu ovariální hyperstimulace je také odebrán vzorek krve podle naší standardní klinické praxe, jak bylo popsáno dříve (Lainas et al., 2012, 2013, 2014). Postup přípravy pacientky je stejný jako u většiny gynekologických operací. Pacientka je položena na operační stůl v litotomické poloze a její vnější genitálie jsou omyty roztokem hibitanu (který je považován za mírnější než použití betadinového peelingu) a poté opláchnut fyziologickým roztokem. Po provedení standardního čištění rukou a paží si chirurgův asistent nasadí chirurgické rukavice a otevře balíčky sterilizovaných nástrojů, včetně předehřátých a sterilizovaných trubicových bloků, které jsou umístěny na sterilizované chirurgické papírové ručníky ve fázi ohřevu. Sterilizované odběrové zkumavky jsou umístěny v topném bloku pro použití během procedury. Pokud je během procedury potřeba více zkumavek, asistující sestra by měla asepticky umístit další zkumavky do topného bloku. Pacient je poté pokryt sterilizovanými chirurgickými ručníky na těle a nohou. Sonda ultrazvuku je dezinfikována CIDEXem po dobu 5 minut a poté omyta velkým množstvím vody na injekci. Po zavedení vaginálního dilatátoru se pochva promyje DPBS až po cervikální os. Asistent si poté oblékne nové chirurgické rukavice a plášť a zakryje pacienta dalšími sterilizovanými chirurgickými papírovými rouškami. Předem sterilizovaný vodič jehly oocytů se otevře a spolu s proplachovacími stříkačkami se promyje DPBS. Jedna injekční stříkačka se opatrně naplní DPBS, který se použije k propláchnutí jehly a poté se zlikviduje. Ultrazvuková sonda se poté asepticky umístí na roušky pacienta, nasadí se na ni vodítko jehly a sonda se nakonec připojí k ultrazvukové centrální jednotce. Otevře se předehřátá 16G jehla pro odběr oocytů s dvojitým lumenem a aspirační pumpa se nastaví na 250 mmHG. Různé konektory hadiček jehly jsou připojeny k: a) aspirační pumpě, b) proplachovací stříkačce, c) první zkumavce pro odběr oocytů.

Chirurg provádí standardní drhnutí rukou a paží, nosí chirurgický plášť a chirurgické rukavice, než zaujme chirurgickou pozici u chirurgického stolu. Jehla a její hadička se před použitím promyjí propláchnutím teplým DPBS a první odběrová zkumavka se vyhodí. To zajišťuje, že jehla/hadička je před propíchnutím folikulu naplněna DPBS. Anesteziolog pacientku uklidňuje a po celou dobu výkonu sleduje její dýchání a srdeční činnost.

Embryologická laboratorní příprava Celý embryologický postup se provádí pod digestoří s laminárním prouděním, s vyhřívaným podstavcem nastaveným na 40 °C, aby vydržel teplotu misky 37+/-0,2 oC. Embryolog připravuje centrální jamkové kultivační misky s HEPES médiem. Prázdné předehřáté kulaté misky, tepelně leštěné sklo Pasteurovy pipety a prázdná nádoba na vyřazenou folikulární tekutinu jsou umístěny na vyhřívaném pracovním stole. Vše výše uvedené by mělo být jasně označeno podrobnostmi o pacientech.

Během procedury

Lékař umístí jehlu pro odběr oocytů do vodiče a poté ji připojí k transvaginální sondě ultrazvuku. Poté provede ultrazvukový odhad vaječníků a Douglasova vaku. Poté, co lokalizoval folikuly, propíchne vaginální stěnu jehlou v místě sousedícím s prvním vaječníkem a pokračuje v odsávání všech antrálních folikulů. větší než (...mm).

Při odsávání každého folikulu se tekutina shromažďuje v hadičce a asistent chirurga ji nahradí novou hadičkou z vyhřívaného stupně. Sestra vezme naplněnou zkumavku a odhadne její objem na základě volumetricky označené „referenční“ zkumavky. Objemový odhad je založen na řadě zkumavek o známém objemu. Zkumavka je pak rychle umístěna do topného bloku v embryologické laboratoři (přes spojovací okénko). Zkumavky jsou umístěny zleva doprava na zahřívacím bloku, přičemž místo zcela vlevo je vyhrazeno pro tekutiny z nově odsátých folikulů a pozice zcela vpravo pro zkumavky obsahující propláchnutou folikulární tekutinu.

Embryolog vezme zkumavku a opatrně nalije obsah každé zkumavky do misky. Poté hledá komplex Cumulus-Oocyte Complex (COC) prostřednictvím svého mikroskopu. Výsledky tohoto vyhledávání jsou sděleny lékaři a spadají do tří kategorií: a) COC nalezen, b) COC nenalezen, ale folikulární buňky jsou přítomny, c) COC nenalezeny a folikulové buňky nejsou přítomny. Když je COC nalezen, lékař přejde k dalšímu folikulu, zatímco embryolog jej přenese do příkopu odběrové misky a důkladně jej promyje, než jej přesune do centrální jamky. Pokud COC není nalezeno, lékař poté přistoupí k vypláchnutí DPBS do folikulu pomocí injekční stříkačky. Vypláchnutý objem by neměl překročit 50 % počátečního objemu folikulu, aby nedošlo k jeho prasknutí, které by mohlo způsobit krvácení folikulu. Propláchnutá tekutina se poté odsaje a postup se opakuje, jak je popsáno výše. Tento proces se opakuje, dokud není COC nalezen nebo dokud není provedeno 4-5 výplachů. Když v proplachovací stříkačce dojde DPBS, vymění se za novou, která byla pečlivě a asepticky naplněna těsně před použitím (ne více než 2 minuty před použitím, aby teplota výrazně neklesla).

Jak postup pokračuje, embryolog umístí COC do odběrové misky, dokud se neodebere maximálně 10. Pro další COC by měla být použita nová miska. Po ukončení odběru oocytů jsou oocyty přeneseny do misek obsahujících Fertovo médium a umístěny do inkubátoru. Poté, co se embryolog ujistil, že byly prohledány všechny zkumavky, informuje lékaře o konečném počtu odebraných oocytů. Před ukončením procedury lékař naposledy skenuje vaječníky a Douglasův váček, a pokud je detekována nadbytečná tekutina, odsaje co nejvíce. Nakonec lékař vyjme jehlu a sondu a zajistí, aby nedošlo k vaginálnímu krvácení.

Faktory přispívající k úspěšnému získání oocytů

Transvaginální odběr oocytů je komplikovaný postup s mnoha proměnnými, které je třeba vzít v úvahu, aby byl úspěšný. Nežádoucí účinky operace mohou být ovlivněny délkou výkonu, dovedností lékaře a typem použité jehly. Délka procedury je primárně ovlivněna počtem odebraných oocytů a snadností, se kterou byly odebrány. Procedury, které zahrnují proplachování folikulů, jsou v průměru delší než procedury bez proplachování. Šířka jehly (měřidlo) přímo ovlivňuje míru vaginálního krvácení a míru bolesti, kterou pacientka pociťuje v důsledku operace. Výše uvedené proměnné (proplachování a šířka jehly) byly navrženy jako hlavní faktory pro účinnost odběru oocytů, tj. počet odebraných oocytů.

Proplachování folikulů Proplachování bylo navrženo jako metoda, která může zvýšit výtěžek oocytů díky skutečnosti, že oocyty, které nejsou okamžitě získány z folikulu, mohou být po propláchnutí odebrány. Jehly s dvojitým lumenem umožňují proplachování pomocí dvou kanálků v jehle, jednoho pro odsávání folikulů a jednoho pro proplachování. O jeho rutinním použití se však vedou spory především kvůli delšímu trvání procedur, ale také kvůli riziku krvácení a infekce ze zrudnutí. V průběhu let bylo provedeno mnoho studií porovnávajících proplachování (s jehlami s dvojitým lumenem) a žádné proplachování (s jehlami s jedním lumenem), s protichůdnými výsledky.

Cochranův přehled publikovaný v roce 2010, který hodnotil použití proplachování, nenašel žádný významný přínos při použití jehel s dvojitým lumenem. V nedávné randomizované studii provedené na klinice EUGONIA bylo zjištěno, že zrudnutí je spojeno s významně vyšší mírou získání ve srovnání s žádným zrudnutím pomocí jehly 16G Casmed s dvojitým lumenem. Kromě toho bylo přibližně 97 % odebraných oocytů získáno během prvních 3 výplachů a bylo zjištěno, že oocyty mají podobnou rychlost zrání a oplodnění bez ohledu na počet požadovaných výplachů, což naznačuje, že malý počet výplachů může zvýšit konečný počet vývojově kompetentních odebrané oocyty.

Pokud jde o bezpečnost výplachů, dodržení výše uvedeného protokolu, zejména s ohledem na aseptické techniky, minimalizuje riziko infekce z výplachů. Je třeba zdůraznit, že je třeba dbát na to, aby nedošlo k prasknutí folikulů příliš intenzivním vyplachováním. Množství DPBS vyplaveného do folikulu by nemělo přesáhnout 50 % objemu folikulu a folikuly s nadměrnou vaskularizací by se neměly vyplachovat vůbec. Zákrok by měl provádět zkušený tým, aby byla zajištěna bezpečnost pacienta a zároveň se minimalizovala doba operace.

Aspirační jehly Významným parametrem při porovnávání jehel a aspiračních technik je pracovní průměr jehly použité k odsávání. To platí zejména při provádění odběrů oocytů s použitím folikulárního proplachu. Jehly s dvojitým lumenem mají zpravidla menší pracovní průměry ve srovnání s jehlami s podobným průměrem s jedním lumenem. Tuto skutečnost je třeba vzít v úvahu při nastavování podtlaku na aspirační pumpě, protože dvoulumenové jehly budou vyžadovat podstatně vyšší tlak, aby bylo dosaženo podobného průtoku jako jednolumenové jehly. Dokonce i podobné jehly s dvojitým lumenem od různých výrobců mohou mít různé vnitřní průměry lumen, což výrazně mění jejich výkon, protože i malé změny průměru mají velký vliv na průtok. Níže je uvedeno srovnání průměrů některých běžně používaných aspiračních jehel. Vnitřní průměr v kategorii dvojitého lumenu se vztahuje k pracovnímu průměru vnitřního lumenu. Všimněte si významných rozdílů v průměrech mezi jehlami s podobným kalibrem.

JEDEN LUMEN DVOJLUMEN 16G 16G 17G 17G 16G 16G 17G 17G VNĚJŠÍ VNITŘNÍ VNITŘNÍ VNITŘNÍ VNITŘNÍ VNITŘNÍ VNITŘNÍ STĚNA 1,7 1,24 1,42 1 1,7 1,17,93 1,6 NET 1,4 1 1,65 1 1,5 0,8 VITROLIFE 1,6 1,1 1,4 1 1,6 1 1,5 0,9 CASMED n/a n/a n/a n/a 1,65 0, 81 n/a n/a