Lavagem Folicular versus Aspiração Direta

Este será um estudo observacional prospectivo pareado sobre o efeito da taxa de recuperação de oócitos de lavagem folicular, maturidade de oócitos, taxa de fertilização e desenvolvimento e utilização de embriões em comparação com aspiração direta (sem lavagem) em mulheres submetidas a tratamento de fertilização in vitro.

Em cada mulher inscrita, um ovário (direito ou esquerdo) será aleatoriamente designado para ser aspirado com lavagem folicular ou aspiração direta sem lavagem. O endpoint primário será a taxa de recuperação de oócitos (oócitos recuperados por folículo aspirado). Os resultados secundários serão a maturidade do oócito, a taxa de fertilização e o desenvolvimento e utilização do embrião. As taxas de gravidez serão relatadas como um resultado substituto.

COLETA TRANSVAGINAL DE OÓCITOS

Após a estimulação ovariana controlada (COS), a maturação final do oócito é desencadeada usando hCG ou triptorrelina. A coleta de oócitos é realizada 35-36 horas após o desencadeamento. O procedimento envolve a aspiração transvaginal de folículos guiada por ultrassom por meio de uma agulha de aspiração de duplo lúmen (16G, Casmed). É necessária uma equipe interdisciplinar para o procedimento, incluindo ginecologistas, embriologistas parteiras/enfermeiras e anestesistas. É realizada em bloco operatório ginecológico, contíguo a um laboratório de embriologia, com a paciente sedada e sob condições assépticas e rigorosa regulamentação das condições ambientais para garantir a viabilidade oocitária e a segurança da paciente.

Antes do procedimento Um dia antes do procedimento, o embriologista prepara placas de cultura (Placas Falcon Central Well) contendo meio tamponado com bicarbonato especificamente projetado para cultura de oócitos (Fert, Origio) coberto com óleo mineral (Fertipro). As placas são colocadas em uma incubadora de 5-7% de CO2 a 37oC para equilibrar durante a noite. Alíquotas de meio tamponado HEPES (Flushing medium, Origio) que atingem a regulação do pH fora da incubadora são pré-aquecidas a 37oC. Finalmente, frascos de 160 ml de DPBS (solução salina tamponada com fosfato) para uso em lavagem folicular são colocados na incubadora do centro cirúrgico para pré-aquecimento. Todo o preparo embriológico é realizado assepticamente sob capela de fluxo laminar.

O procedimento utiliza equipamento cirúrgico que é autoclavado e embalado em panos cirúrgicos estéreis. Todos os materiais que entram em contato com o fluido folicular, como agulhas de ovócitos, seringas de 20 ml (não tóxicas, BD) e tubos de coleta (tubos de FIV de 14 ml, NUNC), são testados por FIV via MEA (sobrevivência de blastocisto de camundongo), pré-esterilizados e uso único. Estes são armazenados antes do uso em uma câmara de aquecimento de 37oC.

Usamos uma agulha de duplo lúmen 16G (Casmed, Reino Unido) que permite aspiração contínua e lavagem dos folículos. A agulha tem 30 cm de comprimento e marcas ecogênicas próximas à ponta para facilitar o reconhecimento sob orientação de ultrassom transvaginal. O comprimento do tubo é de 60 cm e inclui um tampão para conexão a um tubo de teste padrão e tubo separado com trava Luer para conexão a uma seringa para lavagem. A agulha e suas conexões são todas fabricadas em aço inoxidável cirúrgico de alta qualidade. A tubulação é fabricada em PTFE (politetrafluoretileno) translúcido.

Todos os produtos são fabricados de acordo com os padrões de qualidade ISO 9001:2008, ISO 13485 e marcação CE.

Preparação para o procedimento Preparação do paciente Antes de entrar na sala de cirurgia, o anestesiologista confirma o histórico médico da paciente pertinente à anestesia iminente.

A paciente é acompanhada até a sala de cirurgia e sua identidade é confirmada por duas pessoas, que assinam o documento de testemunha. Em pacientes com muito poucos oócitos esperados (resposta fraca, fertilização in vitro leve ou ciclos naturais), uma ultrassonografia transvaginal é realizada pelo médico assistente imediatamente antes do procedimento para confirmar a presença e localização de folículos maduros. Em casos de alto risco para síndrome de hiperestimulação ovariana, uma amostra de sangue também é coletada, de acordo com nossa prática clínica padrão, conforme descrito anteriormente (Lainas et al., 2012, 2013, 2014). O procedimento seguido para o preparo da paciente é o mesmo da maioria das cirurgias ginecológicas. A paciente é deitada na mesa de operação em posição de litotomia e sua genitália externa é lavada com solução de hibitano (que é considerada mais suave do que usar esfoliante de betadine) e depois enxaguada com solução salina. Depois de realizar uma esfoliação padrão de mãos e braços, o assistente do cirurgião usa luvas cirúrgicas e abre os pacotes de ferramentas esterilizadas, incluindo blocos de tubos pré-aquecidos e esterilizados, que são colocados em toalhas de papel cirúrgico esterilizadas em um estágio de aquecimento. Tubos de coleta esterilizados são colocados no bloco de aquecimento, para uso durante o procedimento. Se durante o procedimento forem necessários mais tubos, a enfermeira assistente deve colocar assepticamente mais tubos no bloco de aquecimento. O paciente é então coberto com toalhas cirúrgicas esterilizadas no corpo e nas pernas. A sonda do ultrassom é desinfetada com CIDEX por 5 minutos e depois lavada com grandes quantidades de água para injeção. Após a inserção de um dilatador vaginal, a vagina é lavada com DPBS até o orifício cervical. O assistente então usa novas luvas cirúrgicas e avental e cobre o paciente com campos adicionais de papel cirúrgico esterilizado. A guia de agulha de oócito pré-esterilizado é aberta e ela e as seringas de irrigação são lavadas com DPBS. Uma seringa é cuidadosamente preenchida com DPBS, que será usado para lavar a agulha e depois descartado. A sonda de ultrassom é então colocada assepticamente nos campos do paciente, a guia da agulha é conectada a ela e a sonda é finalmente conectada à unidade central de ultrassom. Uma agulha de coleta de oócitos de duplo lúmen 16 G pré-aquecida é aberta e a bomba de aspiração é ajustada para 250 mmHG. Os vários conectores de tubulação da agulha são conectados a: a) a bomba de aspiração, b) a seringa de irrigação, c) o primeiro tubo de coleta de oócitos.

O cirurgião realiza uma esfoliação padrão de mão e braço, veste uma bata cirúrgica e luvas cirúrgicas antes de assumir a posição cirúrgica na mesa cirúrgica. A agulha e seu tubo são lavados com DPBS morno antes do uso e o primeiro tubo de coleta é descartado. Isso garante que toda a agulha/tubo seja preenchida com DPBS antes de perfurar o folículo. O anestesiologista seda a paciente e monitora sua respiração e função cardíaca durante todo o procedimento.

Preparo do Laboratório Embriológico Todo o procedimento embriológico é realizado em capela de fluxo laminar, com estágio aquecido regulado a 40oC para suportar temperatura da placa de 37+/-0,2 oC. O embriologista prepara placas de cultura do poço central com meio HEPES. Pratos redondos pré-aquecidos vazios, pipetas Pasteur de vidro polido termicamente e um recipiente vazio para fluido folicular descartado são todos colocados na bancada aquecida. Todos os itens acima devem ser claramente rotulados com os detalhes do paciente.

Durante o procedimento

O médico coloca a agulha de coleta de ovócitos no guia e a conecta à sonda transvaginal do ultrassom. Ele então realiza uma estimativa de ultrassom dos ovários e da bolsa de Douglas. Depois de localizar os folículos, ele punciona a parede vaginal com a agulha em um ponto adjacente ao primeiro ovário e procede à aspiração de todos os folículos antrais. maior que (...mm).

À medida que cada folículo é aspirado, o líquido é recolhido no tubo e o auxiliar do cirurgião o substitui por um novo tubo da etapa aquecida. Uma enfermeira pega o tubo cheio e estima seu volume com base em um tubo de "referência" marcado volumetricamente. A estimativa volumétrica é baseada em uma série de tubos de volume conhecido. O tubo é então colocado rapidamente no bloco de aquecimento dentro do laboratório embriológico (através da janela de conexão). Os tubos são colocados da esquerda para a direita no bloco de aquecimento, com o ponto mais à esquerda sendo reservado para fluidos de folículos recém-aspirados e as posições mais à direita para tubos contendo fluido folicular lavado.

O embriologista pega o tubo e despeja cuidadosamente o conteúdo de cada tubo no prato. Ele então procura o Complexo Cumulus-Oócito (COC) através de seu microscópio. Os resultados desta pesquisa são comunicados ao médico e dividem-se em três categorias: a) COC encontrado, b) COC não encontrado, mas com células foliculares presentes, c) COC não encontrado e sem células foliculares presentes. Quando o COC é encontrado, o médico passa para o próximo folículo, enquanto o embriologista o transfere para o fosso da placa coletora e o lava minuciosamente, antes de deslocá-lo para o poço central. Se o COC não for encontrado, o médico passa a aplicar DPBS no folículo por meio da seringa. O volume lavado não deve exceder 50% do volume inicial do folículo para evitar a ruptura do mesmo, o que pode causar hemorragia do folículo. O fluido lavado é então aspirado e o procedimento é repetido conforme descrito acima. Este processo é repetido até que o COC seja encontrado ou 4-5 lavagens sejam realizadas. Quando a seringa de lavagem fica sem DPBS, ela é substituída por uma nova que foi preenchida com cuidado e assepticamente imediatamente antes do uso (não mais de 2 minutos antes do uso, para que a temperatura não caia significativamente).

À medida que o procedimento continua, os COCs são colocados pelo embriologista na placa de coleta até que no máximo 10 sejam coletados. Um novo prato deve ser usado para COCs adicionais. Após o término da coleta de oócitos, os oócitos são transferidos para placas contendo meio Fert e colocados na incubadora. Após o embriologista ter assegurado que todos os tubos foram examinados, ele informa ao médico o número final de oócitos recuperados. Antes de terminar o procedimento, o médico examina os ovários e a bolsa de Douglas uma última vez e, se for detectado excesso de líquido, ele aspira o máximo possível. Por fim, o médico remove a agulha e a sonda e verifica se não há sangramento vaginal.

Fatores que contribuem para a recuperação bem-sucedida de oócitos

A coleta transvaginal de ovócitos é um procedimento complicado com muitas variáveis ​​que precisam ser consideradas para que seja bem-sucedida. Os efeitos colaterais da operação podem ser afetados pela duração do procedimento, pela habilidade do médico e pelo tipo de agulha utilizada. A duração do procedimento é afetada principalmente pelo número de oócitos coletados e pela facilidade com que foram coletados. Os procedimentos que incluem a lavagem dos folículos são, em média, mais longos do que aqueles sem lavagem. A largura da agulha (calibre) afeta diretamente o nível de sangramento vaginal e o nível de dor que a paciente sente devido à operação. As variáveis ​​acima (lavagem e largura da agulha) foram propostas como fatores principais para a eficácia da coleta de oócitos, ou seja, o número de oócitos recuperados.

Lavagem folicular A lavagem foi proposta como um método que pode aumentar a produção oocitária devido ao fato de que os oócitos que não são imediatamente recuperados do folículo podem ser coletados após a lavagem. As agulhas de lúmen duplo permitem a irrigação por meio do uso de dois canais dentro da agulha, um para aspirar os folículos e outro para irrigação. No entanto, há controvérsias quanto ao seu uso rotineiro principalmente pelo fato de os procedimentos tenderem a durar mais tempo, mas também pelo risco de hemorragia e infecção decorrentes do flushing. Muitos estudos foram realizados ao longo dos anos comparando irrigação (com agulhas de duplo lúmen) e sem irrigação (com agulhas de lúmen único), com resultados conflitantes.

Uma revisão Cochrane publicada em 2010, avaliando o uso de flushing, não encontrou benefício significativo no uso de agulhas de duplo lúmen. Em um recente estudo randomizado realizado na clínica EUGONIA, verificou-se que o rubor estava associado a taxas de recuperação significativamente mais altas em comparação com a ausência de rubor usando uma agulha Casmed de duplo lúmen 16G. Além disso, cerca de 97% dos oócitos coletados foram recuperados nas 3 primeiras descargas e os oócitos apresentaram taxas de maturação e fertilização semelhantes, independentemente do número de descargas necessárias, sugerindo que um pequeno número de descargas pode aumentar o número final de desenvolvimento competente ovócitos recuperados.

Em relação à segurança da descarga, a adesão ao protocolo apresentado acima, principalmente no que diz respeito às técnicas assépticas, minimizará o risco de infecção das descargas. Deve-se enfatizar que deve-se ter cuidado para evitar a ruptura dos folículos por meio de lavagem muito vigorosa. A quantidade de DPBS liberado no folículo não deve exceder 50% do volume do folículo e os folículos com excesso de vascularização não devem ser lavados. O procedimento deve ser realizado por uma equipe experiente para garantir a segurança do paciente e minimizar o tempo de cirurgia.

Agulhas de aspiração Um parâmetro significativo ao comparar as agulhas e as técnicas de recuperação é o diâmetro de trabalho da agulha usada para aspirar. Isso é especialmente verdadeiro ao realizar recuperações de oócitos com o uso de lavagem folicular. As agulhas de duplo lúmen têm, via de regra, diâmetros de trabalho menores em comparação com agulhas de lúmen único de calibre semelhante. Este fato deve ser considerado ao definir a pressão negativa na bomba de aspiração, pois as agulhas de lúmen duplo exigirão uma pressão significativamente maior para atingir uma taxa de fluxo semelhante à das agulhas de lúmen único. Mesmo agulhas de lúmen duplo semelhantes de diferentes fabricantes podem ter diâmetros de lúmen interno diferentes, alterando significativamente seu desempenho, pois mesmo pequenas alterações no diâmetro têm um grande efeito na taxa de fluxo. Abaixo está uma comparação dos diâmetros de algumas agulhas de aspiração comumente usadas. O diâmetro interno na categoria de lúmen duplo refere-se ao diâmetro de trabalho do lúmen interno. Observe as diferenças significativas nos diâmetros entre agulhas de calibre semelhante.

LÚMEN SIMPLES LÚMEN DUPLO 16G 16G 17G 17G 16G 16G 17G 17G EXTERIOR EXTERIOR EXTERIOR EXTERIOR EXTERIOR EXTERIOR EXTERIOR INTERNO PAREDE 1,7 1,24 1,42 1 1,7 1,17 1,5 0,9 GINÉTICA 1,6 1,3 1,4 1 1,65 1 1,5 0,8 VITROLIFE 1,6 1,1 1,4 1 1,6 1 1,5 0,9 CASMED n/a n/a n/a n/a 1,65 0, 81 n/a n/a