Płukanie pęcherzyków a aspiracja bezpośrednia

Będzie to prospektywne badanie obserwacyjne w parach dotyczące wpływu wskaźnika odzyskiwania oocytów z płukania pęcherzyków, dojrzałości oocytów, wskaźnika zapłodnienia oraz rozwoju i wykorzystania zarodka w porównaniu z bezpośrednią aspiracją (bez płukania) u kobiet poddawanych zabiegowi IVF.

U każdej włączonej kobiety jeden jajnik (prawy lub lewy) zostanie losowo przydzielony do aspiracji z płukaniem pęcherzyków lub aspiracją bezpośrednią bez płukania. Pierwszorzędowym punktem końcowym będzie wskaźnik odzyskiwania komórek jajowych (liczba komórek jajowych pobranych na aspirowany pęcherzyk). Drugorzędnymi wynikami będą dojrzałość oocytów, wskaźnik zapłodnienia oraz rozwój i wykorzystanie zarodka. Wskaźniki ciąż będą zgłaszane jako wynik zastępczy.

POCHWOWE POBIERANIE OOCYTÓW

Po kontrolowanej stymulacji jajników (COS) za pomocą hCG lub tryptoreliny wyzwala się końcowe dojrzewanie oocytów. Pobieranie oocytów przeprowadza się 35-36 godzin po wyzwoleniu. Procedura polega na przezpochwowej aspiracji pęcherzyków pod kontrolą USG za pomocą igły aspiracyjnej o podwójnym świetle (16G, Casmed). Do zabiegu potrzebny jest interdyscyplinarny zespół złożony z lekarzy ginekologów, embriologów, położnych/pielęgniarzy i anestezjologów. Wykonywany jest na sali operacyjnej ginekologii, sąsiadującej z pracownią embriologiczną, w sedacji pacjentki, w warunkach aseptycznych i ściśle uregulowanych warunków środowiskowych zapewniających żywotność oocytów i bezpieczeństwo pacjentki.

Przed zabiegiem Na dzień przed zabiegiem embriolog przygotowuje szalki hodowlane (szalki Falcon Central Well) zawierające pożywki buforowane wodorowęglanami, przeznaczone specjalnie do hodowli oocytów (Fert, Origio) pokryte olejem mineralnym (Fertipro). Szalki umieszcza się w inkubatorze z 5-7% CO2 w temperaturze 37oC w celu zrównoważenia przez noc. Porcje pożywki buforowanej HEPES (pożywka Flushing, Origio), która umożliwia regulację pH poza inkubatorem, są wstępnie podgrzewane do 37oC. Na koniec 160 ml kolby DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) do stosowania w płukaniu mieszków włosowych umieszcza się w inkubatorze teatru w celu wstępnego ogrzania. Całość przygotowania embriologicznego odbywa się w warunkach aseptycznych pod wyciągiem z przepływem laminarnym.

Do zabiegu wykorzystuje się sprzęt chirurgiczny, który jest sterylizowany w autoklawie i pakowany w sterylne chusty chirurgiczne. Wszystkie materiały mające kontakt z płynem pęcherzykowym, takie jak igły do ​​oocytów, strzykawki 20 ml (nietoksyczne, BD) i probówki do pobierania (probówki IVF 14 ml, NUNC), są testowane IVF za pomocą testu MEA (przeżywalność blastocysty myszy), wstępnie sterylizowane i jednorazowego użytku. Są one przechowywane przed użyciem w komorze grzewczej o temperaturze 37oC.

Używamy igły o podwójnym świetle 16G (Casmed, Wielka Brytania), która umożliwia ciągłą aspirację i płukanie mieszków włosowych. Igła ma długość 30 cm i oznaczenia echogeniczne w pobliżu końcówki, co ułatwia jej rozpoznanie pod kontrolą ultrasonografii przezpochwowej. Długość wężyka wynosi 60 cm i zawiera korek do podłączenia do standardowej probówki oraz osobny wężyk z luer-lock do podłączenia do strzykawki do płukania. Igła i jej połączenia są wykonane z wysokiej jakości chirurgicznej stali nierdzewnej. Wąż jest wykonany z półprzezroczystego PTFE (politetrafluoroetylenu).

Wszystkie produkty wytwarzane są zgodnie z normami jakości ISO 9001:2008, ISO 13485 oraz oznakowaniem CE.

Przygotowanie do zabiegu Przygotowanie Pacjenta Przed wejściem na salę operacyjną anestezjolog potwierdza historię medyczną pacjentki dotyczącą zbliżającego się znieczulenia.

Pacjentka jest eskortowana na salę operacyjną, a jej tożsamość potwierdzają dwie osoby, które podpisują dokument świadka. U pacjentek z bardzo małą liczbą oczekiwanych komórek jajowych (słabo reagujące, łagodne IVF lub cykle naturalne) tuż przed zabiegiem lekarz prowadzący wykonuje USG przezpochwowe w celu potwierdzenia obecności i lokalizacji dojrzałych pęcherzyków. W przypadkach wysokiego ryzyka zespołu hiperstymulacji jajników pobierana jest również próbka krwi, zgodnie z naszą standardową praktyką kliniczną, jak opisano wcześniej (Lainas i in., 2012, 2013, 2014). Procedura przygotowania pacjentki jest taka sama jak w przypadku większości zabiegów ginekologicznych. Pacjentkę układa się na stole operacyjnym w pozycji do litotomii, a zewnętrzne narządy płciowe przemywa się roztworem hibitanu (uważanym za łagodniejszy niż peeling betadyną), a następnie spłukuje solą fizjologiczną. Po wykonaniu standardowego peelingu dłoni i ramion, asystent chirurga zakłada rękawiczki chirurgiczne i otwiera wysterylizowane pakiety narzędzi, w tym wstępnie ogrzane i wysterylizowane bloki rurek, które umieszcza się na wysterylizowanych chirurgicznych ręcznikach papierowych w ramach etapu podgrzewania. Wysterylizowane probówki do pobierania umieszcza się w bloku grzejnym do wykorzystania podczas zabiegu. Jeśli podczas zabiegu potrzeba więcej rurek, pielęgniarka aseptyczna powinna umieścić więcej rurek w bloku grzejnym. Następnie ciało i nogi pacjenta okrywa się wysterylizowanymi ręcznikami chirurgicznymi. Głowicę ultrasonografu dezynfekuje się preparatem CIDEX przez 5 minut, a następnie przemywa dużą ilością wody do iniekcji. Po wprowadzeniu rozszerzacza dopochwowego pochwę przemywa się DPBS aż do ujścia szyjki macicy. Asystent następnie zakłada nowe rękawiczki chirurgiczne i fartuch oraz przykrywa pacjenta dodatkowymi sterylnymi serwetami z papieru chirurgicznego. Wstępnie wysterylizowana prowadnica igły do ​​oocytów jest otwierana i strzykawki płuczące są myte DPBS. Jedna strzykawka jest starannie napełniana DPBS, który zostanie użyty do przepłukania igły, a następnie wyrzucony. Następnie sondę ultrasonograficzną układa się aseptycznie na obłożeniach pacjenta, mocuje się do niej prowadnicę igły, a na koniec sondę podłącza się do centrali ultrasonograficznej. Wstępnie ogrzaną igłę do pobierania oocytów o podwójnym świetle 16 G otwiera się i pompę aspiracyjną ustawia się na 250 mmHG. Różne złącza rurek igły są podłączone do: a) pompy aspiracyjnej, b) strzykawki płuczącej, c) pierwszej probówki do pobierania oocytów.

Chirurg wykonuje standardowy peeling dłoni i ramion, zakłada fartuch chirurgiczny i rękawiczki chirurgiczne przed przyjęciem pozycji chirurgicznej przy stole operacyjnym. Igłę i jej rurkę przemywa się przez przepłukanie ciepłym DPBS przed użyciem, a pierwszą probówkę zbierającą wyrzuca się. Zapewnia to, że cała igła/rurka zostanie wypełniona DPBS przed nakłuciem pęcherzyka. Anestezjolog wprowadza pacjentkę w stan sedacji i monitoruje jej oddech oraz pracę serca przez cały czas trwania zabiegu.

Przygotowanie Laboratorium Embriologicznego Cała procedura embriologiczna przeprowadzana jest pod wyciągiem laminarnym, ze stolikiem grzewczym ustawionym na 40oC, aby wytrzymać temperaturę szalki 37+/-0,2 oC. Embriolog przygotowuje centralne szalki do hodowli z pożywką HEPES. Puste, podgrzane okrągłe naczynia, polerowane na gorąco szklane pipety Pasteura i pusty pojemnik na zużyty płyn pęcherzykowy są umieszczane na podgrzewanym stole warsztatowym. Wszystkie powyższe powinny być wyraźnie oznaczone danymi pacjenta.

Podczas procedury

Lekarz umieszcza igłę do pobierania oocytów w prowadnicy, a następnie mocuje ją do przezpochwowej sondy USG. Następnie wykonuje ocenę ultrasonograficzną jajników i kieszonki Douglasa. Po zlokalizowaniu pęcherzyków nakłuwa igłą ścianę pochwy w miejscu przylegającym do pierwszego jajnika i przystępuje do aspiracji wszystkich pęcherzyków antralnych. większy niż (...mm).

Gdy każdy pęcherzyk jest zasysany, płyn jest zbierany w rurce, a asystent chirurga zastępuje ją nową rurką z podgrzanego stolika. Pielęgniarka bierze napełnioną probówkę i szacuje jej objętość na podstawie oznaczonej objętościowo probówki „referencyjnej”. Szacowanie objętościowe opiera się na szeregu probówek o znanej objętości. Probówka jest następnie szybko umieszczana w bloku grzejnym w laboratorium embriologicznym (przez okienko łączące). Rurki są umieszczane od lewej do prawej na bloku grzejnym, przy czym skrajne lewe miejsce jest zarezerwowane dla płynów z nowo aspirowanych pęcherzyków, a skrajne prawe pozycje dla probówek zawierających wypłukany płyn pęcherzykowy.

Embriolog bierze probówkę i ostrożnie wlewa zawartość każdej probówki do naczynia. Następnie szuka kompleksu Cumulus-Oocyte (COC) przez swój mikroskop. Wyniki tego wyszukiwania są przekazywane lekarzowi i dzielą się na trzy kategorie: a) znaleziono COC, b) nie znaleziono COC, ale komórki pęcherzyka są obecne, c) nie znaleziono COC i nie ma komórek pęcherzyka. Po znalezieniu COC lekarz przechodzi do następnego pęcherzyka, podczas gdy embriolog przenosi go do rowka naczynia do pobierania i dokładnie go myje przed przeniesieniem do centralnego dołka. Jeśli COC nie zostanie znaleziony, lekarz przystępuje do wstrzyknięcia DPBS do mieszka włosowego za pomocą strzykawki. Objętość płukania nie powinna przekraczać 50% początkowej objętości pęcherzyka, aby uniknąć jego pęknięcia, co może spowodować krwotok z pęcherzyka. Przepłukany płyn jest następnie zasysany i procedura jest powtarzana, jak opisano powyżej. Proces ten jest powtarzany do momentu znalezienia COC lub wykonania 4-5 przepłukań. Gdy w strzykawce do płukania skończy się DPBS, wymienia się ją na nową, starannie i aseptycznie napełnioną tuż przed użyciem (nie więcej niż 2 minuty przed użyciem, aby temperatura nie spadła znacząco).

W trakcie procedury embriolog umieszcza COC w naczyniu do pobierania, aż do zebrania maksymalnie 10. W przypadku dodatkowych złożonych doustnych środków antykoncepcyjnych należy użyć nowej szalki. Po zakończeniu pobierania oocytów komórki jajowe przenosi się do szalek zawierających pożywkę Fert i umieszcza w inkubatorze. Po upewnieniu się, że wszystkie jajowody zostały przeszukane, embriolog informuje lekarza o ostatecznej liczbie pobranych oocytów. Przed zakończeniem zabiegu lekarz po raz ostatni skanuje jajniki i kieszonkę Douglasa iw przypadku wykrycia nadmiaru płynu aspiruje jak najwięcej. Na koniec lekarz usuwa igłę i sondę i upewnia się, że nie ma krwawienia z pochwy.

Czynniki przyczyniające się do pomyślnego pobrania oocytów

Przezpochwowe pobieranie oocytów jest skomplikowaną procedurą z wieloma zmiennymi, które należy uwzględnić, aby było skuteczne. Na skutki uboczne operacji może mieć wpływ długość zabiegu, umiejętności lekarza i rodzaj użytej igły. Na długość zabiegu wpływa przede wszystkim liczba pobranych komórek jajowych oraz łatwość ich pobrania. Procedury obejmujące płukanie mieszków włosowych są średnio dłuższe niż te bez płukania. Szerokość igły (miernika) wpływa bezpośrednio na stopień krwawienia z pochwy oraz na poziom bólu odczuwanego przez pacjentkę w związku z operacją. Powyższe zmienne (przepłukiwanie i szerokość igły) zostały zaproponowane jako główne czynniki skuteczności pobrania oocytów, tj. liczby pobranych oocytów.

Płukanie pęcherzyka Zaproponowano płukanie jako metodę, która może zwiększyć wydajność oocytów, ponieważ oocyty, które nie są natychmiast pobierane z pęcherzyka, można pobrać po wypłukaniu. Igły o podwójnym świetle umożliwiają płukanie za pomocą dwóch kanałów w igle, jednego do zasysania mieszków włosowych i jednego do płukania. Jednak jego rutynowe stosowanie budzi kontrowersje, głównie ze względu na dłuższy czas trwania zabiegów, ale także ze względu na ryzyko krwotoków i infekcji w wyniku zaczerwienienia. Na przestrzeni lat przeprowadzono wiele badań porównujących zaczerwienienie (z igłami o podwójnym świetle) i brak zaczerwienienia (z igłami o jednym świetle), ze sprzecznymi wynikami.

W przeglądzie Cochrane opublikowanym w 2010 r., oceniającym stosowanie płukania, nie stwierdzono znaczących korzyści ze stosowania igieł o podwójnym świetle. W niedawnym randomizowanym badaniu przeprowadzonym w klinice EUGONIA wykazano, że zaczerwienienie było związane ze znacznie wyższymi wskaźnikami pobierania w porównaniu z brakiem zaczerwienienia przy użyciu igły Casmed o podwójnym świetle 16G. Ponadto około 97% zebranych oocytów zostało pobranych w ciągu pierwszych 3 płukań, a stwierdzono, że oocyty mają podobne wskaźniki dojrzewania i zapłodnienia niezależnie od wymaganej liczby płukań, co sugeruje, że niewielka liczba płukań może zwiększyć ostateczną liczbę kompetentnych rozwojowo komórek pobrane komórki jajowe.

Jeśli chodzi o bezpieczeństwo spłukiwania, przestrzeganie przedstawionego powyżej protokołu, zwłaszcza w zakresie technik aseptycznych, zminimalizuje ryzyko zakażenia spowodowanego spłukiwaniem. Należy podkreślić, że należy uważać, aby nie dopuścić do pęknięcia mieszków włosowych poprzez zbyt gwałtowne płukanie. Ilość DPBS wpłukiwana do mieszka nie powinna przekraczać 50% objętości pęcherzyka, a pęcherzyków z nadmiernym unaczynieniem nie należy w ogóle wypłukiwać. Zabieg powinien być wykonywany przez doświadczony zespół, aby zapewnić pacjentowi bezpieczeństwo przy jednoczesnym zminimalizowaniu czasu trwania zabiegu.

Igły aspiracyjne Istotnym parametrem przy porównywaniu igieł i technik pobierania jest średnica robocza igły używanej do aspiracji. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku pobierania komórek jajowych za pomocą płukania pęcherzyków. Igły dwukanałowe mają z reguły mniejsze średnice robocze w porównaniu do igieł jednokanałowych o podobnym przekroju. Fakt ten należy wziąć pod uwagę przy ustawianiu podciśnienia na pompie ssącej, ponieważ igły dwukanałowe będą wymagały znacznie wyższego ciśnienia, aby osiągnąć podobne natężenie przepływu jak igły jednokanałowe. Nawet podobne igły o podwójnym świetle różnych producentów mogą mieć różne średnice światła wewnętrznego, co znacznie zmienia ich działanie, ponieważ nawet niewielkie zmiany średnicy mają duży wpływ na szybkość przepływu. Poniżej znajduje się porównanie średnic niektórych powszechnie używanych igieł aspiracyjnych. Wewnętrzna średnica w kategorii podwójnego światła odnosi się do roboczej średnicy wewnętrznego światła. Zwróć uwagę na znaczne różnice w średnicach między igłami o podobnym rozstawie.

POJEDYNCZE ŚWIATŁO PODWÓJNE ŚWIATŁO 16G 16G 17G 16G 16G 16G 17G 17G ZEWNĘTRZNE WEWNĘTRZNE ZEWNĘTRZNE WEWNĘTRZNE ZEWNĘTRZNE ZEWNĘTRZNE WEWNĘTRZNE ŚCIANA 1,7 1,24 1,42 1 1,7 1,17 1,5 0,9 GINETYKA 1,6 1,3 1,4 1 1,65 1 1,5 0,8 VITROLIFE 1,6 1,1 1,4 1 1,6 1 1,5 0,9 CASMED nie dotyczy nie dotyczy nie dotyczy nie dotyczy 1,65 0, 81 nie dotyczy nie dotyczy