Фолликулярная промывка по сравнению с прямой аспирацией

Это будет проспективное обсервационное парное исследование влияния промывания фолликулов на скорость восстановления ооцитов, зрелость ооцитов, скорость оплодотворения, развитие и использование эмбрионов по сравнению с прямой аспирацией (без промывания) у женщин, проходящих ЭКО.

У каждой включенной женщины один яичник (правый или левый) будет случайным образом назначен для аспирации либо с промывкой фолликулов, либо прямой аспирацией без промывки. Первичной конечной точкой будет скорость извлечения ооцитов (количество ооцитов, полученных на аспирированный фолликул). Вторичными результатами будут зрелость ооцитов, скорость оплодотворения, развитие и использование эмбрионов. Показатели беременности будут представлены как суррогатный результат.

ТРАНСВАГИНАЛЬНЫЙ ЗАБОР Ооцитов

После контролируемой стимуляции яичников (COS) окончательное созревание ооцитов запускается с помощью ХГЧ или трипторелина. Забор ооцитов проводят через 35-36 часов после запуска. Процедура включает трансвагинальную аспирацию фолликулов под контролем УЗИ с помощью двухпросветной аспирационной иглы (16G, Casmed). Для проведения процедуры требуется междисциплинарная команда, в которую входят гинекологи, эмбриологи, акушерки/медсестры и анестезиологи. Он проводится в гинекологической операционной, примыкающей к эмбриологической лаборатории, с седацией пациентки, в асептических условиях и со строгим регулированием условий окружающей среды для обеспечения жизнеспособности ооцитов и безопасности пациента.

Перед процедурой За день до процедуры эмбриолог готовит чашки для культивирования (чашки Falcon Central Well), содержащие бикарбонатную буферную среду, специально предназначенную для культивирования ооцитов (Fert, Origio), покрытую минеральным маслом (Fertipro). Чашки помещают в инкубатор с 5-7% CO2 при 37oC для уравновешивания в течение ночи. Аликвоты забуференной среды HEPES (среда Flushing, Origio), в которой достигается регулирование pH вне инкубатора, предварительно нагревают до 37oC. Наконец, 160-мл флаконы с DPBS (фосфатно-солевой буфер) для использования при промывании фолликулов помещают в инкубатор операционной для предварительного нагревания. Вся эмбриологическая подготовка проводится в асептических условиях под ламинарным вытяжным шкафом.

В процедуре используется хирургическое оборудование, которое автоклавируется и упаковывается в стерильные хирургические ткани. Все материалы, вступающие в контакт с фолликулярной жидкостью, такие как иглы для ооцитов, шприцы на 20 мл (нетоксичные, BD) и пробирки для сбора (14 мл пробирки для ЭКО, NUNC), тестируются методом ЭКО с помощью теста MEA (выживание бластоцисты мыши), предварительно стерилизованы и одноразового использования. Перед использованием они хранятся в камере для подогрева при температуре 37oC.

Мы используем двухпросветную иглу 16G (Casmed, Великобритания), которая обеспечивает непрерывную аспирацию и промывание фолликулов. Игла имеет длину 30 см и эхогенную маркировку у кончика для легкого распознавания под трансвагинальным ультразвуковым контролем. Длина трубки составляет 60 см и включает пробку для соединения со стандартной пробиркой и отдельную трубку с замком Люэра для соединения со шприцем для промывки. Игла и ее соединения изготовлены из высококачественной хирургической нержавеющей стали. Трубка изготовлена ​​из полупрозрачного ПТФЭ (политетрафторэтилена).

Вся продукция производится в соответствии со стандартами качества ISO 9001:2008, ISO 13485 и маркировкой CE.

Подготовка к процедуре Подготовка пациента Перед входом в операционную анестезиолог подтверждает историю болезни пациентки, относящуюся к предстоящей анестезии.

Пациентку сопровождают в операционную, и ее личность подтверждают два человека, которые подписывают протокол свидетельских показаний. У пациенток с очень небольшим числом ожидаемых ооцитов (слабый ответ, мягкое ЭКО или естественные циклы) непосредственно перед процедурой лечащий врач проводит трансвагинальное УЗИ, чтобы подтвердить наличие и расположение зрелых фолликулов. В случаях высокого риска синдрома гиперстимуляции яичников также берут образец крови в соответствии с нашей стандартной клинической практикой, как описано ранее (Lainas et al., 2012, 2013, 2014). Процедура подготовки пациентки такая же, как и при большинстве гинекологических операций. Больную укладывают на операционный стол в положении для литотомии и промывают наружные половые органы раствором гибитана (который считается более мягким, чем использование бетадинового скраба), а затем промывают физиологическим раствором. После выполнения стандартной обработки рук и рук ассистент хирурга надевает хирургические перчатки и открывает стерилизованные упаковки инструментов, включая предварительно нагретые и стерилизованные блоки трубок, которые помещаются на стерилизованные хирургические бумажные полотенца в зоне нагрева. Стерилизованные пробирки для сбора помещаются в нагревательный блок для использования во время процедуры. Если во время процедуры требуется больше трубок, ассистентская медсестра должна асептически поместить дополнительные трубки в нагревательный блок. Затем пациента накрывают стерильными хирургическими полотенцами на теле и ногах. Ультразвуковой датчик дезинфицируют CIDEX в течение 5 минут, а затем промывают большим количеством воды для инъекций. После введения вагинального расширителя влагалище промывают DPBS до зева шейки матки. Затем ассистент надевает новые хирургические перчатки и халат и накрывает пациента дополнительными стерилизованными хирургическими бумажными салфетками. Предварительно стерилизованный проводник иглы для ооцитов открывается, и он и промывочные шприцы промываются DPBS. Один шприц осторожно заполняется DPBS, который будет использоваться для промывки иглы, а затем выбрасывается. Затем ультразвуковой датчик в асептических условиях помещается на простыни пациента, к нему прикрепляется направляющая иглы, и, наконец, датчик подключается к центральному ультразвуковому блоку. Предварительно нагретую двухпросветную иглу для сбора ооцитов на 16 G открывают и аспирационную помпу устанавливают на 250 мм рт.ст. Различные соединители трубок иглы подключены к: а) аспирационному насосу, б) промывочному шприцу, в) первой пробирке для сбора ооцитов.

Хирург выполняет стандартную очистку рук и рук, надевает хирургический халат и хирургические перчатки, прежде чем занять хирургическое положение на операционном столе. Иглу и ее трубку перед использованием промывают теплым DPBS, а первую пробирку для сбора выбрасывают. Это гарантирует, что игла/трубка полностью заполнена DPBS перед проколом фолликула. Анестезиолог вводит пациентке седативный эффект и контролирует ее дыхание и работу сердца на протяжении всей процедуры.

Эмбриологическая лабораторная подготовка Вся эмбриологическая процедура проводится под ламинарным вытяжным шкафом с подогревом предметного столика при температуре 40°C, чтобы выдержать температуру чашки 37+/-0,2. °С. Эмбриолог готовит чашки для культивирования в центральных лунках со средой HEPES. Пустые предварительно нагретые круглые чашки, термополированные стеклянные пипетки Пастера и пустой контейнер для отработанной фолликулярной жидкости помещаются на обогреваемый рабочий стол. Все вышеперечисленное должно быть четко помечено сведениями о пациенте.

Во время процедуры

Врач помещает иглу для сбора ооцитов в проводник, а затем прикрепляет ее к трансвагинальному ультразвуковому датчику. Затем он выполняет ультразвуковое исследование яичников и дугласова пространства. Обнаружив фолликулы, он прокалывает стенку влагалища иглой в точке, прилегающей к первому яичнику, и приступает к аспирации всех антральных фолликулов. больше, чем (... мм).

По мере аспирации каждого фолликула жидкость собирается в трубку, и ассистент хирурга заменяет ее новой трубкой из нагретого столика. Медсестра берет наполненную трубку и оценивает ее объем на основе объемной маркировки «эталонной» трубки. Объемная оценка основана на серии трубок известного объема. Затем пробирку быстро помещают в нагревательный блок внутри эмбриологической лаборатории (через соединительное окно). Пробирки располагают слева направо на нагревательном блоке, при этом крайняя левая точка предназначена для жидкости из недавно аспирированных фолликулов, а крайняя правая позиция – для пробирок, содержащих смытую фолликулярную жидкость.

Эмбриолог берет пробирку и осторожно выливает содержимое каждой пробирки в чашку. Затем он ищет комплекс Cumulus-Oocyte (COC) через свой микроскоп. Результаты этого поиска сообщаются врачу и делятся на три категории: а) КОК обнаружены, б) КОК не обнаружены, но присутствуют фолликулярные клетки, в) КОК не обнаружены и фолликулярные клетки отсутствуют. Когда КОК обнаружен, врач переходит к следующему фолликулу, а эмбриолог переносит его в канавку чашки для сбора и тщательно промывает перед перемещением в центральную лунку. Если КОК не обнаружен, врач вводит DPBS в фолликул через шприц. Промываемый объем не должен превышать 50% исходного объема фолликула, чтобы избежать его разрыва, который может вызвать кровотечение из фолликула. Затем промытую жидкость отсасывают, и процедура повторяется, как описано выше. Этот процесс повторяется до тех пор, пока не будет найден КОК или не будет выполнено 4-5 промывок. Когда в промывочном шприце заканчивается DPBS, его заменяют новым, который был тщательно и асептически заполнен непосредственно перед использованием (не более чем за 2 минуты до использования, чтобы температура не падала значительно).

По мере продолжения процедуры эмбриолог размещает КОК в чашке для сбора до тех пор, пока не будет собрано не более 10. Для дополнительных КОК следует использовать новую посуду. По окончании сбора ооциты переносят в чашки со средой Ферта и помещают в инкубатор. После того, как эмбриолог убедится, что все пробирки осмотрены, он сообщает врачу об окончательном количестве извлеченных ооцитов. Перед окончанием процедуры врач в последний раз сканирует яичники и дугласово пространство и, если обнаруживается избыток жидкости, максимально аспирирует. Наконец, врач извлекает иглу и зонд и убеждается в отсутствии вагинального кровотечения.

Факторы, способствующие успешному извлечению ооцитов

Трансвагинальное извлечение ооцитов является сложной процедурой с множеством переменных, которые необходимо учитывать, чтобы сделать ее успешной. Побочные эффекты от операции могут зависеть от продолжительности процедуры, навыков врача и типа используемой иглы. На продолжительность процедуры в первую очередь влияет количество собранных ооцитов и легкость их сбора. Процедуры, включающие промывание фолликулов, в среднем дольше, чем процедуры без промывания. Ширина иглы (калибр) напрямую влияет на уровень вагинального кровотечения и уровень боли, которую пациентка испытывает в связи с операцией. Вышеупомянутые переменные (промывка и ширина иглы) были предложены в качестве основных факторов эффективности сбора ооцитов, т.е. количества извлеченных ооцитов.

Промывка фолликулов Промывка была предложена как метод, который может увеличить выход ооцитов из-за того, что ооциты, которые не были сразу извлечены из фолликула, могут быть собраны после промывки. Иглы с двойным просветом позволяют проводить промывание за счет использования двух каналов внутри иглы: одного для аспирации фолликулов и другого для промывания. Тем не менее, существуют разногласия относительно его рутинного использования, в основном из-за того, что процедуры, как правило, длятся дольше, а также из-за риска кровотечения и инфекции при промывании. На протяжении многих лет было проведено множество исследований, сравнивающих промывание (двухпросветными иглами) и отсутствие промывания (однопросветными иглами), с противоречивыми результатами.

Кокрановский обзор, опубликованный в 2010 году, оценивал использование промывания и не обнаружил значительных преимуществ от использования игл с двойным просветом. В недавнем рандомизированном исследовании, проведенном в клинике EUGONIA, было обнаружено, что промывание связано со значительно более высокими показателями извлечения по сравнению с отсутствием промывания с использованием двухпросветной иглы Casmed 16G. Кроме того, около 97% собранных ооцитов было получено в течение первых 3 промывок, и было обнаружено, что ооциты имеют одинаковую скорость созревания и оплодотворения независимо от количества требуемых промывок, что позволяет предположить, что небольшое количество промывок может увеличить конечное количество способных к развитию извлечены ооциты.

Что касается безопасности промывания, то соблюдение представленного выше протокола, особенно в отношении асептических методов, сведет к минимуму риск инфицирования при промывании. Следует подчеркнуть, что следует соблюдать осторожность, чтобы избежать разрыва фолликулов из-за слишком интенсивного промывания. Количество DPBS, попадающего в фолликул, не должно превышать 50% объема фолликула, а фолликулы с избыточной васкуляризацией вообще не должны подвергаться промыванию. Процедура должна выполняться опытной командой, чтобы обеспечить безопасность пациента, а также свести к минимуму продолжительность операции.

Иглы для аспирации Важным параметром при сравнении игл и методов извлечения является рабочий диаметр иглы, используемой для аспирации. Это особенно верно при проведении забора ооцитов с использованием промывания фолликулов. Двухпросветные иглы, как правило, имеют меньший рабочий диаметр по сравнению с однопросветными иглами аналогичного диаметра. Этот факт следует учитывать при настройке отрицательного давления на аспирационном насосе, так как двухпросветные иглы потребуют значительно более высокого давления для достижения такой же скорости потока, как и однопросветные иглы. Даже одинаковые двухпросветные иглы разных производителей могут иметь разный внутренний диаметр просвета, что существенно влияет на их эффективность, поскольку даже небольшие изменения диаметра оказывают большое влияние на скорость потока. Ниже приведено сравнение диаметров некоторых широко используемых аспирационных игл. Внутренний диаметр в категории двойного просвета относится к рабочему диаметру внутреннего просвета. Обратите внимание на значительные различия в диаметрах между иглами одинакового калибра.

ОДИНАРНЫЙ ПРОСВЕТ ДВОЙНОЙ ПРОСВЕТ 16G 16G 17G 17G 16G 16G 17G 17G ВНЕШНИЙ ВНУТРЕННИЙ ВНЕШНИЙ ВНУТРЕННИЙ ВНЕШНИЙ ВНУТРЕННИЙ ВНЕШНИЙ ВНУТРЕННИЙ WALLACE 1,7 1,24 1,42 1 1,7 1,17 1,5 0,9 GYNETICS 1,6 1,3 1,4 1 1,65 1 1,5 0,8 VITROLIFE 1,6 1,1 1,4 1 1,6 1 1,5 0,9 CASMED н/д н/д н/д н/д 1,65 0, 81 н/д н/д