Lavaggio follicolare contro aspirazione diretta

Questo sarà uno studio prospettico osservazionale accoppiato sull'effetto del tasso di recupero degli ovociti con lavaggio follicolare, maturità degli ovociti, tasso di fecondazione e sviluppo e utilizzo dell'embrione rispetto all'aspirazione diretta (senza lavaggio) nelle donne sottoposte a trattamento di fecondazione in vitro.

In ogni donna arruolata, un'ovaia (destra o sinistra) verrà assegnata in modo casuale per essere aspirata con lavaggio follicolare o aspirazione diretta senza lavaggio. L'endpoint primario sarà il tasso di recupero degli ovociti (ovociti recuperati per follicolo aspirato). Gli esiti secondari saranno la maturità degli ovociti, il tasso di fecondazione e lo sviluppo e l'utilizzo dell'embrione. I tassi di gravidanza saranno riportati come risultato surrogato.

RACCOLTA TRANSVAGINALE DI VOOCITI

Dopo la stimolazione ovarica controllata (COS), la maturazione finale degli ovociti viene attivata utilizzando hCG o triptorelina. La raccolta degli ovociti viene eseguita 35-36 ore dopo l'attivazione. La procedura prevede l'aspirazione transvaginale ultradound dei follicoli tramite un ago di aspirazione a doppio lume (16G, Casmed). Per la procedura è richiesto un team interdisciplinare, che includa ginecologi, embriologi, ostetriche/infermiere e anestesisti. Viene eseguito in una sala operatoria ginecologica, adiacente a un laboratorio di embriologia, con il paziente sedato e in condizioni asettiche e una rigorosa regolamentazione delle condizioni ambientali per garantire la vitalità degli ovociti e la sicurezza del paziente.

Prima della procedura Il giorno prima della procedura, l'embriologo prepara piatti di coltura (piatti Falcon Central Well) contenenti terreni tamponati con bicarbonato specifici per la coltura di ovociti (Fert, Origio) ricoperti di olio minerale (Fertipro). Le piastre vengono poste in un incubatore di CO2 al 5-7% a 37°C per equilibrarsi durante la notte. Aliquote di terreno tamponato HEPES (terreno di lavaggio, Origio) che raggiunge la regolazione del pH all'esterno dell'incubatore vengono preriscaldate a 37°C. Infine, flaconi da 160 ml di DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato) da utilizzare nel lavaggio follicolare vengono posti nell'incubatrice della sala operatoria per il preriscaldamento. Tutta la preparazione embrionale viene eseguita in condizioni asettiche sotto cappa a flusso laminare.

La procedura utilizza attrezzature chirurgiche autoclavate e confezionate in panni chirurgici sterili. Tutti i materiali che entrano in contatto con il fluido follicolare, come aghi per ovociti, siringhe da 20 ml (non tossici, BD) e tubi di raccolta (provette per fecondazione in vitro da 14 ml, NUNC), sono testati per fecondazione in vitro tramite test MEA (sopravvivenza della blastocisti di topo), pre-sterilizzati e monouso. Questi vengono conservati prima dell'uso in una camera di riscaldamento a 37°C.

Utilizziamo un ago a doppio lume da 16G (Casmed, Regno Unito) che consente l'aspirazione continua e il lavaggio dei follicoli. L'ago ha una lunghezza di 30 cm e segni ecogeni vicino alla punta per un facile riconoscimento sotto guida ecografica transvaginale. La lunghezza del tubo è di 60 cm e comprende un tappo per il collegamento a una provetta standard e un tubo separato con Luer-lock per il collegamento a una siringa per il lavaggio. L'ago e le sue connessioni sono tutti realizzati in acciaio inossidabile chirurgico di alta qualità. Il tubo è realizzato in PTFE traslucido (politetrafluoroetilene).

Tutti i prodotti sono fabbricati in conformità con gli standard di qualità ISO 9001:2008, ISO 13485 e marcatura CE.

Preparazione alla procedura Preparazione del paziente Prima di entrare in sala operatoria, l'anestesista conferma l'anamnesi della paziente relativa alla sua imminente anestesia.

La paziente viene accompagnata in sala operatoria e la sua identità viene confermata da due persone, che firmano il documento testimoniale. Nelle pazienti con pochissimi ovociti attesi (poor responder, FIV lieve o cicli naturali) il medico curante esegue un'ecografia transvaginale appena prima della procedura per confermare la presenza e la posizione dei follicoli maturi. Nei casi ad alto rischio di sindrome da iperstimolazione ovarica viene prelevato anche un campione di sangue, secondo la nostra pratica clinica standard come precedentemente descritto (Lainas et al., 2012, 2013, 2014). La procedura seguita per la preparazione della paziente è la stessa della maggior parte degli interventi ginecologici. La paziente viene adagiata sul tavolo operatorio in posizione litotomica e i suoi genitali esterni vengono lavati con una soluzione di ibitano (che è considerata più blanda rispetto all'utilizzo dello scrub al betadine) e poi risciacquati con soluzione fisiologica. Dopo aver eseguito uno scrub standard di mani e braccia, l'assistente del chirurgo indossa guanti chirurgici e apre i pacchetti di strumenti sterilizzati, inclusi blocchi di tubi preriscaldati e sterilizzati, che vengono posizionati su asciugamani di carta chirurgica sterilizzati durante una fase di riscaldamento. I tubi di raccolta sterilizzati vengono inseriti nel blocco riscaldante, per l'uso durante la procedura. Se durante la procedura sono necessarie più provette, l'infermiere che la assiste deve collocare in modo asettico più provette nel blocco riscaldante. Il paziente viene quindi coperto con teli chirurgici sterilizzati sul corpo e sulle gambe. La sonda degli ultrasuoni viene disinfettata con CIDEX per 5 minuti e poi lavata con abbondante acqua per preparazioni iniettabili. Dopo l'inserimento di un dilatatore vaginale, la vagina viene lavata con DPBS fino all'orifizio cervicale. L'assistente quindi indossa guanti e camice chirurgici nuovi e copre il paziente con ulteriori teli di carta chirurgica sterilizzata. La guida dell'ago dell'ovocita pre-sterilizzata viene aperta e essa e le siringhe di lavaggio vengono lavate con DPBS. Una siringa viene accuratamente riempita con DPBS, che verrà utilizzata per irrigare l'ago e quindi scartata. La sonda ecografica viene quindi posizionata in modo asettico sui teli del paziente, ad essa viene fissata la guida dell'ago e infine la sonda viene collegata all'unità centrale ecografica. Un ago preriscaldato per la raccolta di ovociti a doppio lume da 16 G viene aperto e la pompa di aspirazione viene impostata su 250 mmHG. I vari connettori del tubo dell'ago sono collegati a: a) la pompa di aspirazione, b) la siringa di lavaggio, c) il primo tubo di raccolta degli ovociti.

Il chirurgo esegue uno scrub standard per mani e braccia, indossa un camice chirurgico e guanti chirurgici prima di assumere la posizione chirurgica al tavolo operatorio. L'ago e il suo tubo vengono lavati lavando con DPBS caldo prima dell'uso e il primo tubo di raccolta viene scartato. Ciò garantisce che l'intero ago/tubo sia riempito di DPBS prima di perforare il follicolo. L'anestesista seda la paziente e monitora la sua respirazione e la funzione cardiaca durante tutta la procedura.

Preparazione del laboratorio embriologico L'intera procedura embriologica viene eseguita sotto una cappa a flusso laminare, con un piano riscaldato a 40°C per sopportare una temperatura della piastra di 37+/-0,2 oC. L'embriologo prepara piatti di coltura del pozzo centrale con supporti HEPES. Piatti rotondi preriscaldati vuoti, pipette Pasteur in vetro lucidato a caldo e un contenitore vuoto per il liquido follicolare scartato sono tutti posti sul banco di lavoro riscaldato. Tutto quanto sopra deve essere chiaramente etichettato con i dettagli del paziente.

Durante la procedura

Il medico posiziona l'ago per la raccolta degli ovociti nella guida e poi lo attacca alla sonda transvaginale dell'ecografia. Quindi esegue una stima ecografica delle ovaie e della sacca di Douglas. Dopo aver localizzato i follicoli, perfora con l'ago la parete vaginale in un punto adiacente al primo ovaio e procede all'aspirazione di tutti i follicoli antrali. maggiore di (...mm).

Man mano che ogni follicolo viene aspirato, il fluido viene raccolto nel tubo e l'assistente del chirurgo lo sostituisce con un nuovo tubo proveniente dallo stadio riscaldato. Un'infermiera prende il tubo pieno e ne stima il volume sulla base di un tubo di "riferimento" contrassegnato volumetricamente. La stima volumetrica si basa su una serie di tubi di volume noto. Il tubo viene quindi rapidamente posizionato nel blocco riscaldante all'interno del laboratorio embriologico (tramite la finestra di collegamento). I tubi sono posizionati da sinistra a destra sul blocco riscaldante, con il punto più a sinistra riservato ai fluidi dei follicoli appena aspirati e le posizioni più a destra per i tubi contenenti fluido follicolare lavato.

L'embriologo prende la provetta e versa con cura il contenuto di ogni provetta nel piatto. Quindi cerca il complesso cumulo-ovocita (COC) attraverso il suo microscopio. I risultati di questa ricerca vengono comunicati al medico e rientrano in tre categorie: a) COC trovato, b) COC non trovato ma cellule follicolari presenti, c) COC non trovato e nessuna cellula follicolare presente. Quando il COC viene trovato, il medico passa al follicolo successivo, mentre l'embriologo lo trasferisce nel fossato del piatto di raccolta e lo lava accuratamente, prima di spostarlo nel pozzetto centrale. Se il COC non viene trovato, il medico procede quindi a lavare DPBS nel follicolo tramite la siringa. Il volume lavato non deve superare il 50% del volume iniziale del follicolo per evitare la sua rottura, che potrebbe causare emorragie del follicolo. Il fluido flussato viene quindi aspirato e la procedura viene ripetuta come descritto sopra. Questo processo viene ripetuto fino a quando non viene trovato il COC o vengono eseguiti 4-5 lavaggi. Quando la siringa di lavaggio esaurisce il DPBS, viene sostituita con una nuova che è stata riempita con cura e in modo asettico appena prima dell'uso (non più di 2 minuti prima dell'uso, in modo che la temperatura non scenda in modo significativo).

Man mano che la procedura continua, i COC vengono collocati dall'embriologo nel piatto di raccolta fino a quando non ne vengono raccolti un massimo di 10. Un nuovo piatto dovrebbe essere usato per ulteriori COC. Al termine della raccolta degli ovociti, gli ovociti vengono trasferiti in piastre contenenti terreno Fert e posti nell'incubatrice. Dopo che l'embriologo si è assicurato che tutte le provette siano state perquisite, informa il medico del numero finale di ovociti recuperati. Prima di terminare la procedura il medico scansiona le ovaie e la tasca di Douglas un'ultima volta e se viene rilevato un eccesso di liquido, aspira il più possibile. Infine il medico rimuove l'ago e la sonda e si assicura che non ci sia sanguinamento vaginale.

Fattori che contribuiscono al successo del recupero degli ovociti

Un prelievo transvaginale di ovociti è una procedura complicata con molte variabili che devono essere prese in considerazione per avere successo. Gli effetti collaterali dell'operazione possono essere influenzati dalla durata della procedura, dall'abilità del medico e dal tipo di ago utilizzato. La durata della procedura è principalmente influenzata dal numero di ovociti raccolti e dalla facilità con cui questi sono stati raccolti. Le procedure che includono il lavaggio dei follicoli sono in media più lunghe di quelle senza lavaggio. La larghezza dell'ago (calibro) influisce direttamente sul livello di sanguinamento vaginale e sul livello di dolore che il paziente prova a causa dell'operazione. Le variabili di cui sopra (lavaggio e larghezza dell'ago) sono state proposte come fattori principali per l'efficacia della raccolta degli ovociti, ovvero il numero di ovociti recuperati.

Lavaggio follicolare Il lavaggio è stato proposto come un metodo che può aumentare la resa degli ovociti poiché gli ovociti che non vengono immediatamente recuperati dal follicolo possono essere raccolti dopo il lavaggio. Gli aghi a doppio lume consentono il lavaggio tramite l'uso di due canali all'interno dell'ago, uno per l'aspirazione dei follicoli e uno per il lavaggio. Tuttavia, c'è controversia riguardo al suo uso di routine principalmente a causa del fatto che le procedure tendono a durare più a lungo, ma anche a causa del rischio di emorragia e infezione da arrossamento. Nel corso degli anni sono stati condotti molti studi di confronto tra lavaggio (con aghi a doppio lume) e non lavaggio (con aghi a singolo lume), con risultati contrastanti.

Una revisione Cochrane pubblicata nel 2010, valutata l'uso del lavaggio, non ha riscontrato alcun vantaggio significativo nell'uso di aghi a doppio lume. In un recente studio randomizzato eseguito presso la clinica EUGONIA, il lavaggio è risultato associato a tassi di recupero significativamente più elevati rispetto al non lavaggio con ago Casmed a doppio lume 16G. Inoltre, circa il 97% degli ovociti raccolti è stato recuperato nei primi 3 lavaggi e si è riscontrato che gli ovociti hanno tassi di maturazione e fecondazione simili indipendentemente dal numero di lavaggi richiesti, suggerendo che un piccolo numero di lavaggi può aumentare il numero finale di bambini competenti per lo sviluppo ovociti prelevati.

Per quanto riguarda la sicurezza del lavaggio, l'aderenza al protocollo presentato sopra, in particolare per quanto riguarda le tecniche asettiche, ridurrà al minimo il rischio di infezione da lavaggio. Va sottolineato che è necessario prestare attenzione per evitare la rottura dei follicoli tramite un lavaggio troppo vigoroso. La quantità di DPBS irrorata nel follicolo non deve superare il 50% del volume del follicolo e i follicoli con vascolarizzazione eccessiva non devono essere lavati affatto. La procedura deve essere eseguita da un team esperto per garantire la sicurezza del paziente riducendo al minimo la durata dell'intervento chirurgico.

Aghi di aspirazione Un parametro significativo quando si confrontano sia gli aghi che le tecniche di recupero è il diametro di lavoro dell'ago utilizzato per aspirare. Ciò è particolarmente vero quando si eseguono prelievi di ovociti con l'uso del lavaggio follicolare. Gli aghi a doppio lume hanno di norma diametri di lavoro più piccoli rispetto agli aghi a singolo lume di calibro simile. Questo fatto dovrebbe essere considerato quando si imposta la pressione negativa sulla pompa di aspirazione, poiché gli aghi a doppio lume richiederanno una pressione significativamente più elevata per ottenere una portata simile a quella degli aghi a lume singolo. Anche aghi simili a doppio lume di diversi produttori possono avere diametri interni del lume diversi, alterando significativamente le loro prestazioni, poiché anche piccole variazioni del diametro hanno un grande effetto sulla portata. Di seguito è riportato un confronto dei diametri di alcuni aghi di aspirazione comunemente usati. Il diametro interno nella categoria a doppio lume si riferisce al diametro di lavoro del lume interno. Notare le differenze significative nei diametri tra aghi di calibro simile.

LUMEN SINGOLO LUMEN DOPPIO 16G 16G 17G 17G 16G 16G 17G 17G ESTERNO INTERNO ESTERNO ESTERNO INTERNO ESTERNO INTERNO ESTERNO INTERNO PARETE 1,7 1,24 1,42 1 1,7 1,17 1,5 0,9 GINETICA 1,6 1,3 1,4 1 1,65 1 1,5 0,8 VITROLIFE 1,6 1,1 1,4 1 1,6 1 1,5 0,9 CASMED n/a n/a n/a n/a 1,65 0, 81 n/d n/d