Analýza DNA cirkulujícího nádoru k optimalizaci léčby pacientů s kolorektálním karcinomem (IMPROVE)

1. ÚVOD Kolorektální karcinom (CRC) je celosvětově třetím nejčastějším zhoubným nádorem. Přibližně dvě třetiny pacientů mají zpočátku potenciálně vyléčitelné onemocnění, ale i přes kurativní zamýšlenou léčbu dojde u 30–40 % k relapsu onemocnění. Při diagnóze lze přežití CRC zlepšit v zásadě dvěma způsoby, 1) snížením rizika recidivy dohromady, např. zlepšením chirurgického zákroku nebo nabídkou adjuvantní chemoterapie pacientům s vysokým rizikem recidivy, nebo 2) včasnou detekcí recidivy umožňující včasnou intervenci, která významně zlepšuje přežití pacientů.

   Radikální operace je nejdůležitějším faktorem pro recidivu a přežití CRC, přičemž prvořadý význam mají volné okraje resekce. V Dánsku jsou v současné době realizovány iniciativy k optimalizaci kvality operace, včetně resekce ve správných rovinách a dodržování konceptu kompletní mezokolické excize s centrální ligací tumor vyživujících tepen. Jediné dánské centrum (Hillerød Hospital), které zavedlo tuto techniku, hlásilo podstatně vyšší míru přežití ve srovnání s podobnými dánskými centry používajícími standardní chirurgii.

   Randomizované studie ukázaly, že terapeutický přínos adjuvantní chemoterapie je mírný, zatímco toxicita je podstatná. V souladu s tím byl léčebný přínos zdokumentován pouze u pacientů s nejvyšším rizikem recidivy (stádium III). Nicméně i podskupina pacientů ve stadiu I a ve stadiu II recidivuje a mohla by potenciálně těžit z adjuvantní terapie. Vyvinutí citlivého přístupu k posouzení, zda je po operaci přítomno okultní reziduální onemocnění, je vysoce žádoucí k identifikaci vysoce rizikové podskupiny, které by měla být nabídnuta adjuvantní léčba. Navíc u onemocnění stadia III je dobře zdokumentováno, že mnoho pacientů je přeléčeno adjuvantní terapií. Samotná operace vyléčí > 40 % takových pacientů a počet potřebných k léčbě, aby se zabránilo relapsu, je ~7. Také pro tyto pacienty jsou potřeba lepší a specifičtější markery rizika recidivy.

   Solidní nádory, včetně CRC, uvolňují fragmenty DNA do plazmy. Plazma pacientů s rakovinou obsahuje fragmenty DNA z normálních i rakovinných buněk. Tato DNA se označuje jako bezbuněčná DNA (cfDNA), zatímco specifická frakce, která pochází z nádorových buněk, se nazývá cirkulující nádorová DNA (ctDNA). Výzkumníci nedávno prezentovali výsledky, které v souladu s jinými naznačují, že pacienti s ctDNA detekovanou po operaci jsou vystaveni extrémně vysokému riziku pozdější radiologické recidivy (HR=37,66; 95 % CI, 4,23 až 335,49; P<0,0001). Toto riziko je větší než u pacientů s kolorektálním karcinomem stadia III, kteří jsou běžně léčeni adjuvantní terapií. Tato zjištění ukazují, že pooperační analýza ctDNA má potenciál stát se vysoce cenným nástrojem pro hodnocení kvality primárního chirurgického zákroku a pro vedení použití adjuvantní terapie.

   Ve shodě s ostatními výzkumníci prokázali, že změny ctDNA detekované longitudinální analýzou úzce korelují se změnami v objemu nádoru, jak bylo hodnoceno pomocí CT zobrazení. Analýza ctDNA má tedy potenciál jako nástroj pro hodnocení dopadu intervence (např. chemoterapie, chirurgie, radiofrekvenční ablace (RFA) a stereotaktická terapie těla (SRBT)). Výzkumníci prokázali, že sériová ctDNA analýza umožňuje detekci počínající klinické recidivy onemocnění v průměru 10 měsíců před konvenčními metodami (především CT-scan. V souladu s tím má analýza ctDNA potenciál poskytnout kritické okno příležitosti pro intervenci v časném okamžiku, kdy jsou léčebné modality stále možností.

2. VYŠETŘOVACÍ PLÁN 2.1 Celkový design studie IMPROVE - OBSERVATIONAL STUDIES jsou založeny na komplexní sérii odběrů krve a analýzy ctDNA prováděné u pacientů s CRC před a po operaci, během a po adjuvantní chemoterapii a během sledování. Pacienti jsou sledováni 5 let od data operace.

IMPROVE OBSERVATIONAL STUDIES se logisticky skládají ze dvou částí:

ZLEPŠENÍ POZOROVACÍ STUDIE ČÁST I – CHIRURGIE Tato část obsahuje odběr krve a analýzu ctDNA před operací a bezprostředně po operaci (14. den po operaci) a odběr tkáně z resekovaného vzorku.

ZLEPŠENÍ POZOROVACÍ STUDIE ČÁST II – DOHLED Tato část zahrnuje dlouhodobé odběry krve během 5letého období sledování.

ZLEPŠIT INTERVENČNÍ STUDII - ZLEPŠIT JI Podskupina pacientů zařazených do ZLEPŠENÍ ČÁSTI I - CHIRURGIE jsou kandidáty na zařazení do ZLEPŠENÍ INTERVENČNÍ STUDIE - ZLEPŠIT JI. Studie IMPROVE IT je podrobně popsána v samostatném protokolu.

2.2 Velikost vzorku Zahrneme alespoň 1800 pacientů léčených kurativním záměrem pro stadium I-III onemocnění. Nedávno jsme zveřejnili studii ukazující, že ctDNA byla detekovatelná v plazmě (odebíraná krátce po operaci) u 57 % pacientů ve stadiu II a III s relapsem a u 0 % pacientů bez relapsu. V této studii očekáváme vyšší citlivost, protože budeme analyzovat ~ 8krát větší objemy krve než dříve. Očekáváme následující rozdělení fází: fáze I, 28 %; stupeň II, 37 %; stadium III, 35 %9; a odhadovaných ~223 příhod relapsu (očekávaná míra relapsu: stadium I, 7 %; stadium II, 12 %; stadium III, 17 %). Když zkombinujeme naše předchozí výsledky s velikostí navrhované kohorty a s očekávanou distribucí a událostmi relapsu, převede se to na sílu > 99,9 % na úrovni přesnosti 1 % (dvoustranně) pro potvrzení prognostického významu ctDNA na konec studia.

2.3 Odběr biologických vzorků (Krev a tkáň) 2.3.1 Časové body pro odběr vzorků – ZLEPŠENÍ ČÁST I – CHIRURGIE Všem pacientům zařazeným do části I (Chirurgie) budou odebrány vzorky krve před a po operaci. Kdykoli to bude možné, budou z chirurgického resekovaného vzorku odebrány čerstvé biopsie nádoru a přilehlé normální sliznice, jinak budou z archivů získány tkáně fixované ve formalínu a zalité v parafínu.

2.3.2 Časové body pro odběr vzorků - ZLEPŠENÍ ČÁST II - DOHLED Všem pacientům zařazeným do části II (sledování) budou vzorky krve odebírány podélně během období sledování po operaci: třikrát v roce 1, třikrát v roce 2, dvakrát ve 3. roce a jednou ročně ve 4. a 5. roce.

2.3.3 Časový bod pro identifikaci kandidátů na IMPROVE IT. Kandidáti jsou pacienti s onemocněním stadia I nebo II a BEZ rizikových faktorů způsobilých pro adjuvantní chemoterapii a kteří mají vzorek krve 14. den pozitivní na ctDNA. Pacienti, kteří souhlasili s obdržením výsledku vzorku krve ze 14. dne, jsou osloveni a pozváni k účasti na IMPROVE-IT. Před zařazením je pacientům nabídnuto vyšetření PET-CT, aby se zajistilo, že nebyly přehlédnuty žádné metastázy.

Pokud je vzorek 14. dne ctDNA negativní, pacienti jsou informováni, že jejich riziko relapsu je nízké a že budou sledováni podle pokynů DCCG.

Pacienti s indikací adjuvantní chemoterapie jsou informováni, že NEBUDOU dostávat informace o výsledcích analýzy jejich krevního vzorku ze 14. dne, protože to nezmění jejich plánovanou léčbu. Pacientky jsou žádány, aby souhlasily s longitudinálním odběrem krve a analýzou ctDNA (zařazeno do IMPROVE PART II – SURVEILLANCE), bez ohledu na to, zda dostanou adjuvantní chemoterapii či nikoli.

2.4 Molekulární analýza 2.4.1 Detekce a kvantifikace cirkulující nádorové DNA Detekce a kvantifikace ctDNA bude provedena pomocí našeho nedávno vyvinutého ultrasenzitivního cíleného duplexního sekvenačního přístupu. Pomocí tohoto přístupu sekvenujeme více než 5 000 unikátních molekul DNA z každého vzorku plazmy. Tím je možná detekce somatických mutací s frekvencemi alel až ~0,1 %. Dále naše vylepšená metoda zahrnuje několik kroků zaměřených na snížení chybovosti, včetně použití jedinečných molekulárních čárových kódů specifických pro vlákno (UMI) a redundantního sekvenování každého fragmentu cfDNA. Tím můžeme odlišit chyby vyvolané polymerázou od skutečných mutací.

Přístup sekvenování se zaměřuje na < 100 000 ze 3 miliard bází v lidském genomu. Panel obsahuje nejběžnější a nejdůležitější mutace ovladače CRC identifikované v databázích IntOGEN a TCGA. Pro každý gen se používá více redundantních záchytných sond, aby se zlepšilo pokrytí a poskytla vyšší specificita. Zacílení na tyto oblasti je dostatečné k zajištění toho, že v každém případě CRC bude identifikována alespoň jedna somatická mutace, a mělo by tedy umožnit posouzení hladiny ctDNA u všech zahrnutých pacientů. Genové oblasti zahrnuté v panelu jsou: TP53 exon 5-8 (1792 bází), KRAS kodony 12, 13, 61, 117 a 146 (738 bází), SMAD2 vybrané často mutované oblasti (463 bází), SMAD4 vybrané často mutované oblasti (513 bází), FAM123B vybrané často mutované oblasti (669 bází), SOX9 vybrané často mutované oblasti (693 bází), APC vybrané často mutované oblasti (5477 bází), TCF7L2 vybrané často mutované oblasti (920 bází), NRAS kodony 12, 13 a 61 (405 bází), BRAF kodon 600 a další poblíž (200 bází), FBXW7 vybral často mutované oblasti (868 bází), mutace PIK3CA 8 hotspot (905 bází).

2.5 Sběr klinických informací Ústřední částí projektu je srovnání a korelace hodnocení ctDNA (shromážděných ze vzorků krve) s klinickými informacemi o léčbě a výsledku. Klinické informace týkající se léčby a výsledku léčby budou shromažďovány z nemocničních záznamů a zdravotních registrů.

2.6 Definice prediktorových proměnných, kovariát a koncových bodů 2.6.1 Primární koncový bod

• Přežití bez onemocnění ve 3 letech (3 roky-DFS) 2.6.2 Sekundární koncové body
• Lokální a/nebo vzdálená recidiva (patologická, radiologická nebo klinická)
• Doba do opakování (TTR)
• Přežití bez onemocnění po 1 roce (1y-DFS))
• Celkové přežití v roce 5 (5 let OS)
• Molekulární reziduální nemoc
• Doba do molekulární recidivy (TTMR) 2.6.3 Bezpečnostní koncový bod
• Frekvence a závažnost nežádoucích účinků (AE) ve vztahu k odběrům krve podle protokolu.

2.6.4 Definice koncových bodů

• DFS je definován jako doba od chirurgického zákroku do prvního výskytu kterékoli z následujících událostí; lokoregionální recidivy, vzdálené metastázy nebo úmrtí z jakékoli příčiny.
• Doba do recidivy se počítá od data operace do lokoregionální recidivy nebo vzdálených metastáz nebo úmrtí na kolorektální karcinom.
• Celkové přežití je definováno jako doba od operace do smrti z jakékoli příčiny.
• Molekulární reziduální onemocnění je definováno jako detekce cirkulující nádorové DNA (ctDNA) ve vzorku krve odebraném krátce po ukončení kurativní léčby (mezi 1. a 30. dnem po operaci nebo mezi 1. a 30. dnem po ukončení adjuvantní léčby terapie).
• Doba do molekulární recidivy se vypočítává od prvního okamžiku, kdy není detekovatelná ctDNA, do detekovatelné ctDNA.

2.7 Statistická analýza 2.7.1 Analýza DFS, OS, TTR Kaplan-Meierovy odhady budou použity pro odhad středních časů do recidivy (klinické a molekulární), onemocnění nebo úmrtí a jejich intervalů spolehlivosti, stratifikovaných podle stadia UICC a/nebo stav ctDNA po operaci. Koncové body budou hodnoceny pomocí log-rank testu nebo Coxova regresního modelu, s časem do události (klinická nebo molekulární recidiva nebo smrt) jako proměnnou odezvy a ctDNA po operaci nebo adjuvantní terapii jako faktor.