Cirkulerande tumör-DNA-analys för att optimera behandlingen för patienter med kolorektal cancer (IMPROVE)

1. INTRODUKTION Kolorektal cancer (CRC) är den tredje vanligaste cancerformen i världen. Ungefär två tredjedelar av patienterna uppvisar initialt en potentiellt botad sjukdom, men trots kurativt avsedd behandling upplever 30-40 % återfall av sjukdomen. Vid diagnos kan överlevnaden av CRC i princip förbättras på två sätt, 1) genom att minska risken för återfall tillsammans, t.ex. genom att förbättra kirurgi eller genom att erbjuda adjuvant kemoterapi till patienter med hög risk för återfall, eller 2) genom att tidigt upptäcka återfall som möjliggör tidig intervention som förbättrar patientens överlevnad avsevärt.

   Radikal kirurgi är den viktigaste faktorn för återfall och överlevnad av CRC, och fria resektionsmarginaler är av största vikt. Initiativ för att optimera kvaliteten på kirurgi, inklusive resektion inom rätt plan och efterlevnad av konceptet med fullständig mesokolisk excision med central ligering av tumörmatarartärerna, genomförs för närvarande i Danmark. Ett enda danskt center (Hillerød Hospital) som har implementerat denna teknik har rapporterat avsevärt högre överlevnadsfrekvens jämfört med liknande danska centra som använder standardkirurgi.

   Randomiserade studier har visat att den terapeutiska fördelen med adjuvant kemoterapi är blygsam, medan toxiciteten är betydande. Följaktligen har behandlingsnytta endast dokumenterats för patienter med högst risk för återfall (stadium III). Ändå återkommer även en undergrupp av patienter i stadium I och stadium II och kan potentiellt dra nytta av adjuvant terapi. Utveckling av ett känsligt tillvägagångssätt för att bedöma om ockult kvarvarande sjukdom föreligger efter operation är mycket önskvärt för att identifiera en högriskundergrupp som bör erbjudas adjuvant terapi. För stadium III sjukdom är det dessutom väldokumenterat att många patienter överbehandlas med adjuvant terapi. Enbart kirurgi botar > 40 % av sådana patienter och antalet som behövs för att behandla för att förhindra ett återfall är ~7. Även för dessa patienter finns behov av bättre och mer specifika markörer för risk för återfall.

   Fasta tumörer, inklusive CRC, frisätter DNA-fragment i plasma. Plasma från cancerpatienter innehåller DNA-fragment från både normala celler och cancerceller. Detta DNA kallas cellfritt DNA (cfDNA), medan den specifika fraktion som härrör från tumörceller kallas cirkulerande tumör-DNA (ctDNA). Utredarna har nyligen presenterat resultat som, i linje med andra, indikerar att patienter med ctDNA upptäckt efter operation löper extremt hög risk för ett senare radiologiskt återfall (HR=37,66; 95% Cl, 4,23 till 335,49; P<0,0001). Denna risk är större än hos patienter med stadium III kolorektal cancer som rutinmässigt behandlas med adjuvant terapi. Dessa fynd visar att postoperativ ctDNA-analys har potential att bli ett mycket värdefullt verktyg för bedömning av kvaliteten på den primära operationen och för att vägleda användningen av adjuvant terapi.

   I överensstämmelse med andra har forskarna visat att ctDNA-förändringar som upptäcks genom longitudinell analys korrelerar nära med förändringar i tumörvolymen som bedöms med CT-avbildning. Således har ctDNA-analys potential som ett verktyg för att bedöma effekten av intervention (t.ex. kemoterapi, kirurgi, radiofrekvensablation (RFA) och stereotaktisk kroppsterapi (SRBT)). Utredarna har visat att seriell ctDNA-analys möjliggör detektering av begynnande klinisk sjukdomsrecidiv i genomsnitt 10 månader innan med konventionella metoder (främst CT-skanning. Följaktligen har ctDNA-analys potentialen att ge ett kritiskt fönster av möjlighet till intervention vid en tidig tidpunkt där botande modaliteter fortfarande är ett alternativ.

2. UNDERSÖKNINGSPLAN 2.1 Övergripande studiedesign De IMPROVE - OBSERVATIONELLA STUDIERNA är baserade på en omfattande serie av blodprovstagning och ctDNA-analys utförd på CRC-patienter före och efter operation, under och efter adjuvant kemoterapi och under övervakning. Patienterna följs 5 år från operationsdatum.

IMPROVE OBSERVATIONSSTUDIERNA består logistiskt sett av två delar:

FÖRBÄTTRA OBSERVATIONSSTUDIE DEL I - KIRURGI Denna del omfattar blodprovstagning och ctDNA-analys preoperativt och omedelbart efter operation (post-OP dag 14) och provtagning av vävnad från det resekerade provet.

FÖRBÄTTRA OBSERVATIONSSTUDIE DEL II - ÖVERVAKNING Denna del omfattar longitudinell blodprovtagning under en 5-årig övervakningsperiod.

FÖRBÄTTRA INTERVENTIONELL STUDIE - FÖRBÄTTRA DET En undergrupp av patienter som ingår i FÖRBÄTTRA DEL I - KIRURGI är kandidater för inkludering i FÖRBÄTTRA INTERVENTIONELL STUDY - FÖRBÄTTRA DET. IMPROVE IT-studien beskrivs i detalj i ett separat protokoll.

2.2 Provstorlek Vi kommer att inkludera minst 1800 patienter som behandlas med kurativ avsikt för sjukdom i stadium I-III. Vi har nyligen rapporterat en studie som visar att ctDNA var detekterbart i plasma (uttaget kort efter operationen) från 57 % av patienterna med skov i stadium II och III och hos 0 % av patienterna som inte hade återfall. I den aktuella studien förväntar vi oss en högre känslighet eftersom vi kommer att analysera ~8 gånger större blodvolymer än tidigare. Vi förväntar oss följande stegfördelning: steg I, 28 %; steg II, 37%; steg III, 35%9; och uppskattade ~223 återfallshändelser (förväntade återfallsfrekvenser: stadium I, 7%; stadium II, 12%; stadium III, 17%). När vi kombinerar våra tidigare resultat med storleken på den föreslagna kohorten och med den förväntade distributionen och återfallshändelser, översätts detta till en styrka på >99,9 % vid en precisionsnivå på 1 % (tvåsidigt) för att bekräfta prognostisk signifikans av ctDNA vid slutet av studien.

2.3 Insamling av biologiska prover (blod och vävnad) 2.3.1 Tidpunkter för provtagning - FÖRBÄTTRA DEL I - KIRURGI För alla patienter som ingår i del I (Kirurgi) kommer blodprov att tas före och efter operationen. Närhelst det är möjligt kommer färska tumörer och intilliggande normala slemhinnebiopsier att samlas in från det kirurgiska resekerade provet, annars kommer formalinfixerade paraffininbäddade vävnader att hämtas från arkiven.

2.3.2 Tidpunkter för provtagning - FÖRBÄTTRA DEL II - ÖVERVAKNING För alla patienter som ingår i del II (övervakning) kommer blodprov att tas longitudinellt under den postoperativa uppföljningsperioden: tre gånger år 1, tre gånger år 2, två gånger i årskurs 3 och en gång om året i årskurs 4 och 5.

2.3.3 Tidpunkt för identifiering av kandidater för IMPROVE IT. Kandidaterna är patienter med sjukdomsstadium I eller II och UTAN riskfaktorer som kvalificerar sig för adjuvant kemoterapi, och vars blodprov dag 14 är ctDNA-positivt. Patienter som samtyckt till att ta emot blodprovsresultatet dag 14 kontaktas och uppmanas att delta i IMPROVE-IT. Före inklusionen erbjuds patienterna en PET-CT-undersökning för att säkerställa att inga metastaser har förbisetts.

Om provet dag 14 är ctDNA-negativt informeras patienterna om att deras återfallsrisk är låg och att de kommer att övervakas enligt DCCG:s riktlinjer.

Patienter med indikationer för adjuvant kemoterapi informeras om att de INTE kommer att få information om analysresultaten av sitt blodprov dag 14, eftersom detta inte kommer att förändra deras planerade behandlingsförlopp. Patienterna uppmanas att samtycka till longitudinell blodprovstagning och ctDNA-analys (inkluderas i FÖRBÄTTRA DEL II - ÖVERVAKNING), oavsett om de kommer att få adjuvant kemoterapi eller inte.

2.4 Molekylär analys 2.4.1 Detektion och kvantifiering av cirkulerande tumör-DNA Detektion och kvantifiering av ctDNA kommer att utföras med vår nyligen utvecklade ultrakänsliga målinriktade duplexsekvensering. Med detta tillvägagångssätt kommer vi att sekvensera mer än 5 000 unika DNA-molekyler från varje plasmaprov. Därigenom är det möjligt att detektera somatiska mutationer med allelfrekvenser ner till ~0,1 %. Vidare inkluderar vår förbättrade metod flera steg som syftar till att minska felfrekvensen, inklusive användningen av unika strängspecifika molekylära streckkoder (UMI) och redundant sekvensering av varje cfDNA-fragment. Därigenom kan vi skilja polymerasinducerade fel från verkliga mutationer.

Sekvenseringsmetoden är inriktad på <100 000 av de 3 miljarder baserna i det mänskliga genomet. Panelen omfattar de vanligaste och viktigaste CRC-drivrutinmutationerna identifierade i IntOGEN- och TCGA-databaserna. Flera redundanta infångningssonder används för varje gen för att förbättra täckningen och ge högre specificitet. Att rikta in sig på dessa regioner är tillräckligt för att säkerställa att minst en somatisk mutation kommer att identifieras i varje CRC-fall och bör därför möjliggöra bedömning av ctDNA-nivån hos alla inkluderade patienter. Genregionerna som ingår i panelen är: TP53 exon 5-8 (1792 baser), KRAS kodon 12, 13, 61, 117 och 146 (738 baser), SMAD2 utvalda ofta muterade regioner (463 baser), SMAD4 selekterade ofta muterade regioner (513 baser), FAM123B utvalda ofta muterade regioner (669 baser), SOX9 utvalda ofta muterade regioner (693 baser), APC utvalda ofta muterade regioner (5477 baser), TCF7L2 utvalda ofta muterade regioner (920 baser), NRAS-kodon 12, 13 och 61 (405 baser), BRAF-kodon 600 och andra i närheten (200 baser), FBXW7 utvalda ofta muterade regioner (868 baser), PIK3CA 8 hotspot-mutationer (905 baser).

2.5 Insamling av klinisk information En central del av projektet innebär jämförelse och korrelation av ctDNA-bedömningarna (insamlade från blodproverna) med den kliniska informationen om behandling och utfall. Klinisk information om behandlingen och resultatet av behandlingen kommer att samlas in från sjukhusjournaler och hälsoregister.

2.6 Definitioner av prediktorvariabler, kovariater och slutpunkter 2.6.1 Primär endpoint

• Sjukdomsfri överlevnad vid 3 år (3y-DFS) 2.6.2 Sekundära slutpunkter
• Lokalt och/eller avlägset recidiv (patologiskt, radiologiskt eller kliniskt)
• Tid till upprepning (TTR)
• Sjukdomsfri överlevnad vid 1 år (1y-DFS))
• Total överlevnad vid år 5 (5y-OS)
• Molekylär kvarvarande sjukdom
• Tid till molekylärt återfall (TTMR) 2.6.3 Säkerhetsändpunkt
• Frekvens och svårighetsgrad av biverkningar (AE) i förhållande till blodtappningar enligt protokoll.

2.6.4 Definition av ändpunkter

• DFS definieras som tiden från operation till den första förekomsten av någon av följande händelser; lokoregionalt återfall, fjärrmetastaser eller dödsfall av någon orsak.
• Tid till återfall beräknas från operationsdatum till lokoregionalt återfall eller fjärrmetastaser eller dödsfall i kolorektal cancer.
• Total överlevnad definieras som tiden från operation till dödsfall oavsett orsak.
• Molekylär restsjukdom definieras som detektion av cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) i ett blodprov som tagits kort efter slutet av en kurativt avsedd behandling (mellan dag 1 och dag 30 efter operationen, eller mellan dag 1 och dag 30 efter avslutad adjuvans terapi).
• Tiden till molekylärt återfall beräknas från första gången utan detekterbart ctDNA tills detekterbart ctDNA.

2.7 Statistisk analys 2.7.1 Analys av DFS, OS, TTR Kaplan-Meier-uppskattningar kommer att användas för uppskattning av mediantider till återfall (kliniskt och molekylärt), sjukdom eller död och deras konfidensintervall, stratifierade enligt UICC-stadiet och/eller post-OP ctDNA-status. Endpoints kommer att bedömas med hjälp av log-rank-testet eller en Cox-regressionsmodell, med tid till händelse (kliniskt eller molekylärt återfall eller död) som svarsvariabel och ctDNA efter operation eller adjuvant terapi som faktor.