Анализ ДНК циркулирующей опухоли для оптимизации лечения пациентов с колоректальным раком (IMPROVE)

1. ВВЕДЕНИЕ Колоректальный рак (КРР) является третьим наиболее распространенным видом рака во всем мире. Приблизительно у двух третей пациентов изначально выявляется потенциально излечимое заболевание, но, несмотря на целенаправленное лечение, у 30-40% наблюдается рецидив заболевания. При диагностике выживаемость КРР в основном может быть улучшена двумя способами: 1) за счет снижения риска рецидива в целом, т.е. за счет улучшения хирургического вмешательства или предложения адъювантной химиотерапии пациентам с высоким риском рецидива, или 2) за счет раннего выявления рецидива, позволяющего проводить раннее вмешательство, которое значительно улучшает выживаемость пациентов.

   Радикальная хирургия является наиболее важным фактором для рецидива и выживания CRC, и свободные края резекции имеют первостепенное значение. В настоящее время в Дании реализуются инициативы по оптимизации качества хирургии, включая резекцию в правильных плоскостях и соблюдение концепции полной мезоободочной резекции с центральной перевязкой артерий, питающих опухоль. Единственный датский центр (больница Hillerød), который применил эту технику, сообщил о значительно более высоких показателях выживаемости по сравнению с аналогичными датскими центрами, использующими стандартную хирургию.

   Рандомизированные исследования показали, что терапевтический эффект адъювантной химиотерапии невелик, а токсичность значительна. Соответственно, польза от лечения была зарегистрирована только у пациентов с самым высоким риском рецидива (стадия III). Тем не менее, у части пациентов со стадиями I и II также рецидивы, и им потенциально может помочь адъювантная терапия. Крайне желательно разработать чувствительный подход к оценке наличия скрытой остаточной болезни после операции для выявления подгруппы высокого риска, которой следует предложить адъювантную терапию. Кроме того, хорошо документировано, что для III стадии заболевания многие пациенты чрезмерно лечатся адъювантной терапией. Только хирургическое вмешательство излечивает > 40% таких пациентов, а число пациентов, нуждающихся в лечении для предотвращения рецидива, составляет около 7. Также для этих пациентов необходимы более совершенные и более специфические маркеры риска рецидива.

   Солидные опухоли, включая CRC, выделяют фрагменты ДНК в плазму. Плазма больных раком содержит фрагменты ДНК как нормальных, так и раковых клеток. Эта ДНК называется бесклеточной ДНК (вкДНК), а специфическая фракция, происходящая из опухолевых клеток, называется циркулирующей опухолевой ДНК (цДНК). Исследователи недавно представили результаты, которые, как и другие, указывают на то, что пациенты с цДНК, обнаруженной после операции, имеют чрезвычайно высокий риск более позднего радиологического рецидива (ОР = 37,66; 95% ДИ от 4,23 до 335,49; Р<0,0001). Этот риск выше, чем у пациентов с колоректальным раком III стадии, которые регулярно лечатся адъювантной терапией. Эти результаты показывают, что послеоперационный анализ ctDNA может стать очень ценным инструментом для оценки качества первичной операции и для определения использования адъювантной терапии.

   В согласии с другими исследователи показали, что изменения цДНК, обнаруженные с помощью лонгитюдного анализа, тесно коррелируют с изменениями объема опухоли, оцененными с помощью КТ. Таким образом, анализ цДНК потенциально может использоваться в качестве инструмента для оценки воздействия вмешательства (например, химиотерапия, хирургия, радиочастотная абляция (РЧА) и стереотаксическая терапия тела (SRBT)). Исследователи показали, что серийный анализ цтДНК позволяет выявить начальный клинический рецидив заболевания в среднем за 10 месяцев до этого с помощью традиционных методов (прежде всего КТ-сканирования. Соответственно, анализ цДНК может предоставить критическое окно возможностей для вмешательства в ранний момент времени, когда лечебные методы все еще возможны.

2. ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Общий дизайн исследования IMPROVE – НАБЛЮДАТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ основаны на комплексной серии заборов крови и анализе цДНК, выполненных у пациентов с КРР до и после хирургического вмешательства, во время и после адъювантной химиотерапии и во время наблюдения. Пациенты наблюдаются в течение 5 лет с момента операции.

Логистически IMPROVE OBSERVATIONAL STUDIES состоит из двух частей:

УЛУЧШЕНИЕ НАБЛЮДАТЕЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЧАСТЬ I - ХИРУРГИЯ Эта часть включает забор крови и анализ цДНК до операции и сразу после операции (14-й день после операции), а также забор ткани из резецированного образца.

УЛУЧШЕНИЕ НАБЛЮДАТЕЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЧАСТЬ II - ЭПИДНАДЗОР Эта часть включает продольный отбор проб крови в течение 5-летнего периода наблюдения.

УЛУЧШИТЬ ИНТЕРВЕНЦИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ - УЛУЧШИТЬ ЭТО Подмножество пациентов, включенных в УЛУЧШИТЬ ЧАСТЬ I - ХИРУРГИЯ, являются кандидатами на включение в УЛУЧШЕНИЕ ИНТЕРВЕНЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ - УЛУЧШИТЬ ЭТО. Исследование IMPROVE IT подробно описано в отдельном протоколе.

2.2 Размер выборки Мы включим не менее 1800 пациентов, получавших лечебные средства по поводу I-III стадий заболевания. Недавно мы сообщали об исследовании, показывающем, что цДНК обнаруживалась в плазме (забранной вскоре после операции) у 57% пациентов с рецидивом II и III стадии и у 0% пациентов без рецидива. В настоящем исследовании мы ожидаем более высокой чувствительности, поскольку мы будем анализировать примерно в 8 раз большие объемы крови, чем раньше. Мы ожидаем следующее распределение по стадиям: I стадия — 28%; II стадия - 37%; стадия III — 35%9; и оценено ~ 223 случая рецидива (ожидаемая частота рецидивов: стадия I, 7%, стадия II, 12%, стадия III, 17%). При объединении наших предыдущих результатов с размером предполагаемой когорты и с ожидаемым распространением и рецидивами это приводит к мощности> 99,9% при уровне точности 1% (двусторонний) для подтверждения прогностической значимости цДНК в конец исследования.

2.3 Сбор биологических образцов (Кровь и ткани) 2.3.1 Временные точки для сбора образцов - УЛУЧШИТЬ ЧАСТЬ I - ОПЕРАЦИЯ У всех пациентов, включенных в часть I (Операция), образцы крови будут взяты до и после операции. По мере возможности биоптаты свежей опухоли и прилегающей нормальной слизистой оболочки будут взяты из хирургически резецированного образца, в противном случае из архива будут получены фиксированные формалином ткани, залитые парафином.

2.3.2 Моменты сбора образцов - УЛУЧШИТЬ ЧАСТЬ II - НАБЛЮДЕНИЕ У всех пациентов, включенных в часть II (наблюдение), образцы крови будут взяты продольно в течение послеоперационного периода наблюдения: три раза в год 1, три раза в год 2, дважды в 3-й год и один раз в год в 4-й и 5-й годы.

2.3.3 Момент времени для выявления кандидатов на УЛУЧШЕНИЕ ИТ. Кандидатами являются пациенты со стадией заболевания I или II и БЕЗ факторов риска, подходящие для адъювантной химиотерапии, и у которых образец крови на 14-й день положителен по цДНК. К пациентам, которые согласились получить результат анализа крови на 14-й день, обращаются и приглашают принять участие в программе IMPROVE-IT. Перед включением пациентам предлагается ПЭТ-КТ, чтобы убедиться, что метастазы не пропущены.

Если образец на 14-й день является отрицательным по цтДНК, пациенты информируются о том, что риск рецидива у них низкий и что они будут находиться под наблюдением в соответствии с рекомендациями DCCG.

Пациенты с показаниями к адъювантной химиотерапии информируются о том, что они НЕ получат информацию о результатах анализа их образца крови на 14-й день, так как это не изменит запланированный курс лечения. Пациентов просят дать согласие на продольный забор крови и анализ цДНК (включение в IMPROVE PART II — SURVEILLANCE), независимо от того, будут ли они получать адъювантную химиотерапию или нет.

2.4 Молекулярный анализ 2.4.1 Обнаружение и количественная оценка циркулирующей опухолевой ДНК Обнаружение и количественная оценка ctDNA будут выполняться с использованием нашего недавно разработанного сверхчувствительного подхода целевого дуплексного секвенирования. Используя этот подход, мы секвенируем более 5000 уникальных молекул ДНК из каждого образца плазмы. Таким образом, возможно обнаружение соматических мутаций с частотами аллелей до ~0,1%. Кроме того, наш усовершенствованный метод включает в себя несколько шагов, направленных на снижение частоты ошибок, включая использование уникальных молекулярных штрих-кодов (UMI) для конкретных цепей и избыточное секвенирование каждого фрагмента вкДНК. Таким образом, мы можем отличить ошибки, вызванные полимеразой, от истинных мутаций.

Подход секвенирования нацелен на <100 000 из 3 миллиардов оснований в геноме человека. Панель включает наиболее распространенные и важные мутации драйвера CRC, идентифицированные в базах данных IntOGEN и TCGA. Для каждого гена используется несколько избыточных зондов захвата, чтобы улучшить покрытие и обеспечить более высокую специфичность. Нацеливания на эти области достаточно, чтобы гарантировать, что по крайней мере одна соматическая мутация будет идентифицирована в каждом случае CRC, и, следовательно, должна позволить оценить уровень ctDNA у всех включенных пациентов. Области генов, включенные в панель, следующие: экзон 5-8 TP53 (1792 основания), кодоны KRAS 12, 13, 61, 117 и 146 (738 оснований), SMAD2, выбранные часто мутировавшие области (463 основания), SMAD4, выбранные часто мутировавшие области (513 оснований), FAM123B выбрал часто мутировавшие области (669 оснований), SOX9 выбрал часто мутировавшие области (693 основания), APC выбрал часто мутировавшие области (5477 оснований), TCF7L2 выбрал часто мутировавшие области (920 оснований), кодоны NRAS 12, 13 и 61 (405 оснований), кодон BRAF 600 и другие рядом (200 оснований), FBXW7 выбрал часто мутировавшие области (868 оснований), PIK3CA 8 горячих точек мутаций (905 оснований).

2.5 Сбор клинической информации Центральная часть проекта включает сравнение и корреляцию оценок цДНК (собранных из образцов крови) с клинической информацией о лечении и результатах. Клиническая информация о лечении и результатах лечения будет собираться из больничных записей и регистров здоровья.

2.6 Определения переменных-предикторов, сопутствующих переменных и конечных точек 2.6.1 Первичная конечная точка

• Безрецидивная выживаемость через 3 года (3y-DFS) 2.6.2 Дополнительные конечные точки
• Местный и/или отдаленный рецидив (патологический, рентгенологический или клинический)
• Время до рецидива (TTR)
• Безрецидивная выживаемость через 1 год (1y-DFS))
• Общая выживаемость на 5-м году жизни (5y-OS)
• Молекулярная остаточная болезнь
• Время до молекулярного рецидива (TTMR) 2.6.3 Конечная точка безопасности
• Частота и тяжесть нежелательных явлений (НЯ) по отношению к взятию крови согласно протоколу.

2.6.4 Определение конечных точек

• DFS определяется как время от операции до первого возникновения любого из следующих событий; местно-регионарные рецидивы, отдаленные метастазы или смерть от любой причины.
• Время до рецидива рассчитывается от даты операции до локально-регионарного рецидива или отдаленных метастазов, или смерти от колоректального рака.
• Общая выживаемость определяется как время от операции до смерти от любой причины.
• Молекулярная остаточная болезнь определяется как обнаружение циркулирующей опухолевой ДНК (цДНК) в образце крови, взятом вскоре после окончания лечебно-профилактического лечения (между 1-м и 30-м днем ​​после операции или между 1-м и 30-м днем ​​после окончания адъювантной терапии). терапии).
• Время до молекулярного рецидива рассчитывается с момента первого отсутствия обнаружимой ctDNA до обнаруживаемой ctDNA.

2.7 Статистический анализ 2.7.1 Анализ DFS, OS, TTR Оценки Каплана-Мейера будут использоваться для оценки среднего времени до рецидива (клинического и молекулярного), болезни или смерти и их доверительных интервалов, стратифицированных в соответствии со стадией UICC и/или статус цтДНК после операции. Конечные точки будут оцениваться с использованием логарифмического рангового теста или регрессионной модели Кокса со временем до события (клинический или молекулярный рецидив или смерть) в качестве переменной ответа и послеоперационной или адъювантной терапией цДНК в качестве фактора.