Cirkulerende tumor DNA-analyse for at optimere behandling for patienter med tyktarmskræft (IMPROVE)

1. INTRODUKTION Kolorektal cancer (CRC) er den tredjehyppigste cancer på verdensplan. Omtrent to tredjedele af patienterne har i begyndelsen en potentielt helbredelig sygdom, men på trods af den helbredende tilsigtede behandling oplever 30-40 % tilbagefald af sygdommen. Ved diagnosticering kan overlevelse af CRC grundlæggende forbedres på to måder, 1) ved at reducere risikoen for tilbagefald alt sammen, f.eks. ved at forbedre kirurgi eller ved at tilbyde adjuverende kemoterapi til patienter med høj risiko for recidiv, eller 2) ved tidlig påvisning af recidiv, der muliggør tidlig intervention, som forbedrer patientens overlevelse væsentligt.

   Radikal kirurgi er den vigtigste faktor for recidiv og overlevelse af CRC, og frie resektionsmargener er af afgørende betydning. Initiativer til at optimere kvaliteten af ​​operationen, herunder resektion inden for de korrekte planer og overholdelse af konceptet om fuldstændig mesokolisk excision med central ligering af tumornæringsarterierne, er i øjeblikket ved at blive implementeret i Danmark. Et enkelt dansk center (Hillerød Hospital), som har implementeret denne teknik, har rapporteret væsentligt højere overlevelsesrater sammenlignet med tilsvarende danske centre, der anvender standardkirurgi.

   Randomiserede forsøg har vist, at den terapeutiske fordel ved adjuverende kemoterapi er beskeden, mens toksiciteten er betydelig. Behandlingsgevinster er derfor kun dokumenteret for de patienter med den højeste risiko for tilbagefald (stadium III). Ikke desto mindre kommer også en undergruppe af stadium I- og stadium II-patienter igen og kan potentielt have gavn af adjuverende terapi. Udvikling af en sensitiv tilgang til vurdering af, om okkult restsygdom er til stede efter operation, er yderst ønskelig for at identificere en højrisiko-undergruppe, som bør tilbydes adjuverende terapi. For stadium III sygdom er det desuden veldokumenteret, at mange patienter er overbehandlet med adjuverende terapi. Kirurgi alene helbreder > 40 % af sådanne patienter, og det antal, der skal behandles for at forhindre tilbagefald, er ~7. Også for disse patienter er der behov for bedre og mere specifikke markører for risiko for recidiv.

   Faste tumorer, herunder CRC, frigiver DNA-fragmenter til plasma. Kræftpatienters plasma indeholder DNA-fragmenter fra både normale celler og kræftceller. Dette DNA omtales som cellefrit DNA (cfDNA), mens den specifikke fraktion, der stammer fra tumorceller, kaldes cirkulerende tumor-DNA (ctDNA). Efterforskerne har for nylig præsenteret resultater, der på linje med andre indikerer, at patienter med ctDNA påvist efter operationen har ekstrem høj risiko for et senere radiologisk tilbagefald (HR=37,66; 95 % CI, 4,23 til 335,49; P<0,0001). Denne risiko er større end hos patienter med stadium III kolorektal cancer, som rutinemæssigt behandles med adjuverende terapi. Disse resultater viser, at postoperativ ctDNA-analyse har potentiale til at blive et yderst værdifuldt værktøj til vurdering af kvaliteten af ​​den primære operation og til at vejlede brugen af ​​adjuverende terapi.

   I overensstemmelse med andre har efterforskerne vist, at ctDNA-ændringer påvist gennem longitudinel analyse korrelerer tæt med ændringer i tumorvolumen vurderet ved CT-billeddannelse. Således har ctDNA-analyse potentiale som et værktøj til at vurdere virkningen af ​​intervention (f. kemoterapi, kirurgi, radiofrekvensablation (RFA) og stereotaktisk kropsterapi (SRBT)). Efterforskerne har vist, at seriel ctDNA-analyse muliggør påvisning af begyndende tilbagefald af klinisk sygdom i gennemsnit 10 måneder før ved de konventionelle modaliteter (primært CT-scanning. Derfor har ctDNA-analyse potentialet til at give et kritisk vindue af mulighed for intervention på et tidligt tidspunkt, hvor kurative modaliteter stadig er en mulighed.

2. UNDERSØGELSESPLAN 2.1 Overordnet undersøgelsesdesign De IMPROVE - OBSERVATIONELLE STUDIER er baseret på en omfattende serie af blodprøveudtagning og ctDNA-analyser udført hos CRC-patienter før og efter operation, under og efter adjuverende kemoterapi og under overvågning. Patienterne følges 5 år fra operationsdatoen.

IMPROVE OBSERVATIONSSTUDIES består logistisk af to dele:

FORBEDRE OBSERVATIONSSTUDIE DEL I - KIRURGI Denne del omfatter blodprøvetagning og ctDNA-analyse præoperativt og umiddelbart efter operationen (post-OP dag 14) og prøveudtagning af væv fra den resekerede prøve.

FORBEDRE OBSERVATIONSSTUDIE DEL II - OVERVÅGNING Denne del omfatter longitudinelle blodprøver over en 5-årig overvågningsperiode.

FORBEDRE INTERVENTIONELLE STUDIE - FORBEDRE DET En undergruppe af patienter inkluderet i FORBEDRE DEL I - KIRURGI er kandidater til inklusion i FORBEDRE INTERVENTIONELLE STUDIE - FORBED DET. IMPROVE IT-undersøgelsen er beskrevet detaljeret i en separat protokol.

2.2 Prøvestørrelse Vi vil inkludere mindst 1800 patienter behandlet med helbredende hensigter for stadium I-III sygdom. Vi har for nylig rapporteret en undersøgelse, der viser, at ctDNA var påviselig i plasma (udtaget kort efter operationen) fra 57 % af tilbagefaldende stadium II og III patienter og hos 0 % af patienterne uden tilbagefald. I denne undersøgelse forventer vi en højere følsomhed, da vi vil analysere ~8 gange større blodvolumener end tidligere. Vi forventer følgende trinfordeling: trin I, 28%; trin II, 37%; trin III, 35%9; og estimeret ~223 tilbagefaldsbegivenheder (forventede tilbagefaldsrater: stadium I, 7%; stadium II, 12%; stadium III, 17%). Når vi kombinerer vores tidligere resultater med størrelsen af ​​den foreslåede kohorte og med de forventede distributions- og tilbagefaldsbegivenheder, udmønter dette sig i en styrke på >99,9 % ved et præcisionsniveau på 1 % (to-halet) for at bekræfte prognostisk betydning af ctDNA ved slutningen af ​​studiet.

2.3 Indsamling af biologiske prøver (blod og væv) 2.3.1 Tidspunkter for prøvetagning - FORBEDRING AF DEL I - KIRURGI For alle patienter inkluderet i del I (Kirurgi) vil der blive udtaget blodprøver før og efter operationen. Når det er muligt, vil friske tumorer og tilstødende normale slimhindebiopsier blive indsamlet fra den kirurgiske resekerede prøve, ellers vil formalinfikseret paraffin-indlejret væv blive hentet fra arkiverne.

2.3.2 Tidspunkter for prøvetagning - FORBEDRE DEL II - OVERVÅGNING For alle patienter inkluderet i del II (overvågning) vil der blive udtaget blodprøver i længderetningen i den post-kirurgiske opfølgningsperiode: tre gange i år 1, tre gange i år 2, to gange i 3. årgang og en gang om året i 4. og 5. årgang.

2.3.3 Tidspunkt for identifikation af kandidater til IMPROVE IT. Kandidaterne er patienter med stadium I eller II sygdom og UDEN risikofaktorer, der kvalificerer sig til adjuverende kemoterapi, og hvis dag 14 blodprøve er ctDNA positiv. Patienter, der har givet samtykke til at modtage blodprøveresultatet på dag 14, kontaktes og inviteres til at deltage i IMPROVE-IT. Inden inklusion tilbydes patienterne en PET-CT-scanning for at sikre, at ingen metastaser er blevet overset.

Hvis dag 14 prøven er ctDNA negativ, informeres patienterne om, at deres tilbagefaldsrisiko er lav, og at de vil blive overvåget i henhold til DCCG retningslinjer.

Patienter med indikationer for adjuverende kemoterapi informeres om, at de IKKE vil modtage information om analyseresultaterne af deres dag 14-blodprøve, da dette ikke ændrer deres planlagte behandlingsforløb. Patienterne bliver bedt om at give samtykke til longitudinel blodprøvetagning og ctDNA-analyse (inkludering i IMPROVE PART II - SURVEILLANCE), uanset om de vil modtage adjuverende kemoterapi eller ej.

2.4 Molekylær analyse 2.4.1 Påvisning og kvantificering af cirkulerende tumor-DNA Påvisning og kvantificering af ctDNA vil blive udført ved hjælp af vores nyligt udviklede ultrafølsomme målrettede duplex-sekventeringsmetode. Ved at bruge denne tilgang vil vi sekventere mere end 5.000 unikke DNA-molekyler fra hver plasmaprøve. Derved er påvisning af somatiske mutationer med allelfrekvenser ned til ~0,1 % mulig. Yderligere inkluderer vores forbedrede metode flere trin, der sigter mod at reducere fejlraten, herunder brugen af ​​unikke strengspecifikke molekylære stregkoder (UMI'er) og redundant sekventering af hvert cfDNA-fragment. Derved kan vi skelne polymerase-inducerede fejl fra sande mutationer.

Sekvenseringsmetoden er målrettet mod <100.000 af de 3 milliarder baser i det menneskelige genom. Panelet omfatter de mest almindelige og vigtige CRC-drivermutationer identificeret i IntOGEN- og TCGA-databaserne. Flere redundante indfangningsprober bruges til hvert gen for at forbedre dækningen og give højere specificitet. Målretning af disse regioner er tilstrækkelig til at sikre, at mindst én somatisk mutation vil blive identificeret i hvert CRC-tilfælde og bør derfor muliggøre vurdering af ctDNA-niveauet i alle inkluderede patienter. Genregionerne inkluderet i panelet er: TP53 exon 5-8 (1792 baser), KRAS kodoner 12, 13, 61, 117 og 146 (738 baser), SMAD2 udvalgte hyppigt muterede regioner (463 baser), SMAD4 udvalgte hyppigt muterede regioner (513 baser), FAM123B selekterede hyppigt muterede regioner (669 baser), SOX9 udvalgte hyppigt muterede regioner (693 baser), APC udvalgte hyppigt muterede regioner (5477 baser), TCF7L2 udvalgte hyppigt muterede regioner (920 baser), NRAS-kodoner 12, 13 og 61 (405 baser), BRAF codon 600 og andre i nærheden (200 baser), FBXW7 udvalgte hyppigt muterede regioner (868 baser), PIK3CA 8 hotspot mutationer (905 baser).

2.5 Indsamling af klinisk information En central del af projektet involverer sammenligning og korrelation af ctDNA-vurderingerne (indsamlet fra blodprøverne) med den kliniske information om behandling og resultat. Kliniske oplysninger om behandlingen og resultatet af behandlingen vil blive indsamlet fra hospitalets journaler og sundhedsregistre.

2.6 Definitioner af prædiktorvariabler, kovariater og endepunkter 2.6.1 Primært endepunkt

• Sygdomsfri overlevelse efter 3 år (3y-DFS) 2.6.2 Sekundære endepunkter
• Lokalt og/eller fjernt tilbagefald (patologisk, radiologisk eller klinisk)
• Tid til gentagelse (TTR)
• Sygdomsfri overlevelse efter 1 år (1y-DFS))
• Samlet overlevelse ved år 5 (5y-OS)
• Molekylær restsygdom
• Tid til molekylært tilbagefald (TTMR) 2.6.3 Sikkerhedsendepunkt
• Hyppighed og sværhedsgrad af uønskede hændelser (AE) i forhold til blodudtagningerne pr. protokol.

2.6.4 Definition af endepunkter

• DFS er defineret som tiden fra operation til den første forekomst af en af ​​følgende hændelser; lokoregionalt tilbagefald, fjernmetastaser eller død af enhver årsag.
• Tid til recidiv beregnes fra operationsdato til lokoregionalt recidiv eller fjernmetastaser eller død som følge af kolorektal cancer.
• Samlet overlevelse er defineret som tiden fra operation til død uanset årsag.
• Molekylær restsygdom er defineret som påvisning af cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) i en blodprøve, der er taget kort efter afslutningen af ​​en kurativt tilsigtet behandling (mellem dag 1 og dag 30 efter operationen, eller mellem dag 1 og dag 30 efter afslutning af adjuvans terapi).
• Tid til molekylært tilbagefald beregnes fra første gang uden påviselig ctDNA til påviselig ctDNA.

2.7 Statistisk analyse 2.7.1 Analyse af DFS, OS, TTR Kaplan-Meier estimater vil blive brugt til estimering af mediantider til tilbagefald (klinisk og molekylær), sygdom eller død og deres konfidensintervaller, stratificeret i henhold til UICC-stadiet og/eller post-OP ctDNA status. Endpoints vil blive vurderet ved hjælp af log-rank-testen eller en Cox-regressionsmodel, med tid til hændelse (klinisk eller molekylært tilbagefald eller død) som responsvariabel og ctDNA post-kirurgi eller adjuverende terapi som faktor.