Kiertävän kasvaimen DNA-analyysi kolorektaalisyöpäpotilaiden hoidon optimoimiseksi (IMPROVE)

1. JOHDANTO Kolorektaalisyöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa. Noin kahdella kolmasosalla potilaista on alun perin mahdollisesti parannettavissa oleva sairaus, mutta parantavasti suunnitellusta hoidosta huolimatta 30–40 prosentilla sairaus uusiutuu. Diagnosoituna CRC:n eloonjäämistä voidaan periaatteessa parantaa kahdella tavalla: 1) vähentämällä uusiutumisen riskiä kaikki yhdessä, esim. parantamalla leikkausta tai tarjoamalla adjuvanttia kemoterapiaa potilaille, joilla on korkea uusiutumisriski, tai 2) havaitsemalla uusiutuminen varhaisessa vaiheessa mahdollistaen varhaisen intervention, joka parantaa potilaan eloonjäämistä merkittävästi.

   Radikaalikirurgia on tärkein tekijä CRC:n uusiutumisen ja eloonjäämisen kannalta, ja vapaat resektiomarginaalit ovat ensiarvoisen tärkeitä. Tanskassa toteutetaan parhaillaan aloitteita leikkauksen laadun optimoimiseksi, mukaan lukien resektio oikeissa tasoissa ja täydellisen mesokolisen leikkauksen käsitteen noudattaminen kasvaimen ruokkivien valtimoiden keskusligaatiolla. Yksi tanskalainen keskus (Hillerødin sairaala), joka on ottanut käyttöön tämän tekniikan, on raportoinut huomattavasti korkeammista eloonjäämisluvuista verrattuna vastaaviin tanskalaisiin keskuksiin, joissa käytettiin tavallista leikkausta.

   Satunnaistetut tutkimukset ovat osoittaneet, että adjuvanttikemoterapian terapeuttinen hyöty on vaatimaton, kun taas toksisuus on huomattavaa. Näin ollen hoidon hyödyt on dokumentoitu vain potilaille, joilla on suurin uusiutumisen riski (vaihe III). Siitä huolimatta myös osa I- ja II-vaiheen potilaista uusiutuu ja voisi mahdollisesti hyötyä adjuvanttihoidosta. Herkän lähestymistavan kehittäminen sen arvioimiseksi, esiintyykö piileviä jäännössairauksia leikkauksen jälkeen, on erittäin toivottavaa, jotta voidaan tunnistaa korkean riskin alaryhmä, jolle tulisi tarjota adjuvanttihoitoa. Lisäksi vaiheen III taudin osalta on hyvin dokumentoitu, että monia potilaita ylihoitoa adjuvanttihoidolla. Pelkästään leikkaus parantaa yli 40 % tällaisista potilaista, ja uusiutumisen estämiseksi tarvittava hoito on ~7. Myös näille potilaille tarvitaan parempia ja tarkempia toistumisriskin markkereita.

   Kiinteät kasvaimet, mukaan lukien CRC, vapauttavat DNA-fragmentteja plasmaan. Syöpäpotilaiden plasma sisältää DNA-fragmentteja sekä normaaleista että syöpäsoluista. Tätä DNA:ta kutsutaan soluvapaaksi DNA:ksi (cfDNA), kun taas kasvainsoluista peräisin olevaa spesifistä fraktiota kutsutaan kiertäväksi kasvain-DNA:ksi (ctDNA). Tutkijat ovat äskettäin esittäneet tuloksia, jotka muiden tavoin osoittavat, että potilailla, joilla on leikkauksen jälkeen havaittu ctDNA, on erittäin suuri riski myöhempään radiologiseen uusiutumiseen (HR=37,66; 95 % CI, 4,23 - 335,49; P < 0,0001). Tämä riski on suurempi kuin potilailla, joilla on vaiheen III paksusuolensyöpä ja joita hoidetaan rutiininomaisesti adjuvanttihoidolla. Nämä havainnot osoittavat, että postoperatiivisesta ctDNA-analyysistä voi tulla erittäin arvokas väline primaarileikkauksen laadun arvioinnissa ja adjuvanttihoidon käytön ohjaamisessa.

   Yhdessä muiden kanssa tutkijat ovat osoittaneet, että pitkittäisanalyysillä havaitut ctDNA-muutokset korreloivat läheisesti kasvaimen tilavuuden muutosten kanssa CT-kuvauksella arvioituna. Näin ollen ctDNA-analyysillä on potentiaalia työkaluna interventioiden vaikutuksen arvioimiseen (esim. kemoterapia, leikkaus, radiotaajuusablaatio (RFA) ja stereotaktinen kehohoito (SRBT)). Tutkijat ovat osoittaneet, että sarja ctDNA-analyysi mahdollistaa alkavan kliinisen taudin uusiutumisen havaitsemisen keskimäärin 10 kuukautta aikaisemmin tavanomaisin menetelmin (ensisijaisesti CT-skannauksella. Näin ollen ctDNA-analyysi voi tarjota kriittisen mahdollisuuden interventioon varhaisessa vaiheessa, jolloin parantavat menetelmät ovat edelleen vaihtoehto.

2. TUTKIMUSSUUNNITELMA 2.1 Kokonaistutkimuksen suunnittelu IMPROVE - HAvainnointitutkimukset perustuvat kattavaan sarjaan verinäytteitä ja ctDNA-analyysiä, jotka suoritetaan CRC-potilailla ennen ja jälkeen leikkausta, adjuvanttikemoterapian aikana ja sen jälkeen sekä seurannan aikana. Potilaita seurataan 5 vuoden ajan leikkauksesta.

IMPROVE OBSERVATIONAL SUDIES -tutkimus koostuu logistisesti kahdesta osasta:

PARANTAA HAvainnointitutkintoa OSA I – KIRURGIAT Tämä osa sisältää verinäytteiden oton ja ctDNA-analyysin ennen leikkausta ja välittömästi leikkauksen jälkeen (päivä 14 OP:n jälkeen) ja kudosnäytteiden ottamisen resektoidusta näytteestä.

PARANNETA HAVAINTOTUTKIMUS OSA II – SEURANTA Tämä osa sisältää pitkittäissuuntaisen verinäytteen oton 5 vuoden seurantajakson aikana.

IMPROVE INTERVENTIONAL STUDY - IMPROVE IT Osa potilaista, jotka sisältyvät IMPROVE OSA I - SUURGERY -ohjelmaan, on ehdokkaita sisällytettäväksi IMPROVE INTERVENTIONAL STUY - IMPROVE IT -tutkimukseen. IMPROVE IT -tutkimus on kuvattu yksityiskohtaisesti erillisessä protokollassa.

2.2 Otoskoko Mukaan otetaan vähintään 1800 potilasta, joita hoidetaan vaiheen I-III taudin parantavalla intensiteetillä. Olemme äskettäin raportoineet tutkimuksesta, joka osoitti, että ctDNA oli havaittavissa plasmassa (otettu pian leikkauksen jälkeen) 57 %:lla uusiutuvien vaiheen II ja III potilaista ja 0 %:lla potilaista, joilla ei ollut uusiutumista. Tässä tutkimuksessa odotamme suurempaa herkkyyttä, koska analysoimme ~8 kertaa suurempia verimääriä kuin aiemmin. Odotamme seuraavan vaihejakauman: vaihe I, 28 %; vaihe II, 37 %; vaihe III, 35 %9; ja arvioitu ~223 uusiutumistapahtumaa (odotetut uusiutumistiheydet: vaihe I, 7 %; vaihe II, 12 %; vaihe III, 17 %). Kun aiempia tuloksiamme yhdistetään ehdotetun kohortin kokoon ja odotettuihin jakautumis- ja uusiutumistapahtumiin, tämä tarkoittaa >99,9 %:n tehoa 1 %:n (kaksisuuntaisella) tarkkuustasolla ctDNA:n prognostisen merkityksen vahvistamiseksi tutkimuksen loppu.

2.3 Biologisten näytteiden kerääminen (Veri ja kudos) 2.3.1 Näytteenoton aikapisteet - PARANNA OSA I - KIRURGIAA Kaikilta osaan I (Leikkaus) kuuluvista potilaista otetaan verinäytteitä ennen leikkausta ja sen jälkeen. Leikkausleikkauksesta leikatusta näytteestä otetaan mahdollisuuksien mukaan tuoreet kasvaimet ja viereisen normaalin limakalvon biopsiat, muuten arkistosta saadaan formaliinilla kiinnitettyjä parafiiniin upotettuja kudoksia.

2.3.2 Näytteenoton aikapisteet - PARANNA OSA II - SEURANTA Kaikilta osaan II (valvonta) kuuluvista potilaista otetaan verinäytteitä pitkittäin leikkauksen jälkeisen seurantajakson aikana: kolme kertaa vuonna 1, kolme kertaa vuonna 2, kahdesti vuonna 3 ja kerran vuodessa vuosina 4 ja 5.

2.3.3 Aikapiste ehdokkaiden tunnistamiselle IMPROVE IT:ään. Ehdokkaat ovat potilaat, joilla on vaiheen I tai II sairaus ja ILMAN riskitekijöitä, jotka kelpaavat adjuvanttikemoterapiaan ja joiden 14. päivän verinäyte on ctDNA-positiivinen. Potilaita, jotka suostuivat saamaan 14. päivän verinäytteen tuloksen, lähestytään ja heidät kutsutaan osallistumaan IMPROVE-IT:hen. Ennen sisällyttämistä potilaille tarjotaan PET-CT-skannaus sen varmistamiseksi, että etäpesäkkeitä ei ole jäänyt huomiotta.

Jos 14. päivän näyte on ctDNA-negatiivinen, potilaille kerrotaan, että heidän uusiutumisriskinsä on alhainen ja että heitä seurataan DCCG:n ohjeiden mukaisesti.

Potilaille, joilla on indikaatioita adjuvanttikemoterapiaan, kerrotaan, että he EIVÄT saa tietoa 14. päivän verinäytteensä analyysituloksista, koska tämä ei muuta heidän suunniteltua hoitokulkuaan. Potilaita pyydetään suostumaan pitkittäissuuntaiseen verinäytteenottoon ja ctDNA-analyysiin (sisällytetään IMPROVE PART II - SURVEILLANCE -ohjelmaan), riippumatta siitä, saavatko he adjuvanttia kemoterapiaa vai eivät.

2.4 Molekyylianalyysi 2.4.1 Verenkierron kasvain-DNA:n havaitseminen ja kvantifiointi ctDNA:n havaitseminen ja kvantifiointi suoritetaan käyttämällä äskettäin kehitettyä erittäin herkkää kohdistettua dupleksisekvensointimenetelmäämme. Tätä lähestymistapaa käyttämällä sekvensoimme jokaisesta plasmanäytteestä yli 5 000 ainutlaatuista DNA-molekyyliä. Siten somaattisten mutaatioiden havaitseminen alleelitiheydellä ~ 0,1 %:iin on mahdollista. Lisäksi parannettu menetelmämme sisältää useita vaiheita, joiden tarkoituksena on vähentää virhesuhdetta, mukaan lukien ainutlaatuisten juostespesifisten molekyyliviivakoodien (UMI:iden) käyttö ja kunkin cfDNA-fragmentin redundantti sekvensointi. Siten voimme erottaa polymeraasin aiheuttamat virheet todellisista mutaatioista.

Sekvensointimenetelmä kohdistuu alle 100 000:een ihmisen genomin 3 miljardista emäksestä. Paneeli sisältää yleisimmät ja tärkeimmät CRC-ohjainmutaatiot, jotka on tunnistettu IntOGEN- ja TCGA-tietokannoista. Jokaiselle geenille käytetään useita redundantteja sieppauskoettimia peittävyyden parantamiseksi ja korkeamman spesifisyyden aikaansaamiseksi. Näille alueille kohdistaminen riittää varmistamaan, että jokaisessa CRC-tapauksessa tunnistetaan vähintään yksi somaattinen mutaatio, ja sen pitäisi siksi mahdollistaa ctDNA-tason arvioiminen kaikissa mukana olevissa potilaissa. Paneeliin sisältyvät geenialueet ovat: TP53-eksoni 5-8 (1792 emästä), KRAS-kodonit 12, 13, 61, 117 ja 146 (738 emästä), SMAD2-valitut usein mutatoidut alueet (463 emästä), SMAD4 valittu usein mutatoituneet alueet (513 emästä), FAM123B valitsi usein mutatoituja alueita (669 emästä), SOX9 valitsi usein mutatoituja alueita (693 emästä), APC valitsi usein mutatoituja alueita (5477 emästä), TCF7L2 valitsi usein mutatoituja alueita (920 emästä), NRAS-kodonit 12, 13 ja 61 (405 emästä), BRAF-kodoni 600 ja muut lähellä olevat (200 emästä), FBXW7-valitut usein mutatoidut alueet (868 emästä), PIK3CA 8 -hotspot-mutaatiot (905 emästä).

2.5 Kliinisen tiedon kerääminen Hankkeen keskeinen osa on ctDNA-arvioiden (verinäytteistä kerättyjen) vertailu ja korrelaatio hoitoa ja tuloksia koskevien kliinisten tietojen kanssa. Kliiniset tiedot hoidosta ja hoidon tuloksista kerätään sairaalan asiakirjoista ja terveysrekistereistä.

2.6 Ennustemuuttujien, yhteismuuttujien ja päätepisteiden määritelmät 2.6.1 Ensisijainen päätepiste

• Taudista vapaa eloonjääminen 3 vuoden kohdalla (3v-DFS) 2.6.2 Toissijaiset päätepisteet
• Paikallinen ja/tai etäinen uusiutuminen (patologinen, radiologinen tai kliininen)
• Toistumisen aika (TTR)
• Taudista vapaa eloonjääminen 1 vuoden iässä (1v-DFS)
• Kokonaiseloonjääminen vuonna 5 (5v-OS)
• Molekyylijäännössairaus
• Aika molekyylin uusiutumiseen (TTMR) 2.6.3 Turvallisuuspäätepiste
• Haittavaikutusten esiintymistiheys ja vakavuus suhteessa protokollan mukaisiin verikokeisiin.

2.6.4 Päätepisteiden määrittely

• DFS määritellään ajaksi leikkauksesta minkä tahansa seuraavan tapahtuman ensimmäiseen esiintymiseen; loko-alueellinen uusiutuminen, etäpesäkkeet tai kuolema mistä tahansa syystä.
• Uusiutumiseen kuluva aika lasketaan leikkauspäivästä paikalliseen uusiutumiseen tai etäpesäkkeisiin tai kolorektaalisyövän aiheuttamaan kuolemaan.
• Kokonaiseloonjäämisellä tarkoitetaan aikaa leikkauksesta kuolemaan mistä tahansa syystä.
• Molekyylijäännössairaus määritellään kiertävän kasvain-DNA:n (ctDNA) havaitsemiseksi verinäytteestä, joka on otettu pian parantavasti tarkoitetun hoidon päättymisen jälkeen (päivän 1 ja päivän välillä 30 leikkauksen jälkeen tai päivän 1 ja 30 välillä adjuvantin lopettamisen jälkeen terapia).
• Aika molekyylin uusiutumiseen lasketaan ensimmäisestä ajasta, jolloin ctDNA:ta ei ole havaittavissa, kunnes havaittava ctDNA.

2.7 Tilastollinen analyysi 2.7.1 DFS-, OS-, TTR-analyysi Kaplan-Meier-estimaatteja käytetään arvioitaessa mediaaniaikoja uusiutumiseen (kliininen ja molekyyli), sairauteen tai kuolemaan ja niiden luottamusvälit UICC-vaiheen ja/tai OP:n jälkeinen ctDNA-tila. Päätepisteet arvioidaan käyttämällä log-rank-testiä tai Cox-regressiomallia siten, että aika tapahtumaan (kliininen tai molekulaarinen uusiutuminen tai kuolema) on vastemuuttuja ja ctDNA leikkauksen jälkeinen tai adjuvanttihoito tekijänä.