循环肿瘤 DNA 分析以优化结直肠癌患者的治疗 (IMPROVE)

1. 引言 结直肠癌 (CRC) 是全球第三大常见癌症。 大约三分之二的患者最初表现出可能治愈的疾病，但尽管进行了治愈性治疗，仍有 30-40% 的患者出现疾病复发。 确诊后，基本上可以通过两种方式提高 CRC 的存活率，1) 通过降低复发风险，例如通过改进手术或为复发风险高的患者提供辅助化疗，或 2) 通过及早发现复发，实现早期干预，从而显着提高患者的生存率。

   根治性手术是结直肠癌复发和生存的最重要因素，游离切缘至关重要。 丹麦目前正在实施优化手术质量的举措，包括在正确的平面内切除和坚持完全结肠系膜切除和中央结扎肿瘤供血动脉的概念。 与使用标准手术的类似丹麦中心相比，实施该技术的单一丹麦中心（Hillerød 医院）报告了显着更高的存活率。

   随机试验表明，辅助化疗的治疗益处不大，而毒性很大。 因此，仅记录了复发风险最高的患者（III 期）的治疗获益。 然而，I 期和 II 期患者的一部分也会复发，并可能从辅助治疗中获益。 非常需要开发一种敏感的方法来评估手术后是否存在隐匿性残留病灶，以确定应该提供辅助治疗的高风险亚组。 此外，对于 III 期疾病，有据可查的是，许多患者接受了辅助治疗的过度治疗。 单独手术可治愈 > 40% 的此类患者，并且需要治疗以防止复发的人数约为 7 人。 同样对于这些患者，需要更好和更具体的复发风险标志物。

   包括 CRC 在内的实体瘤会将 DNA 片段释放到血浆中。 癌症患者的血浆中含有来自正常细胞和癌细胞的 DNA 片段。 这种 DNA 被称为无细胞 DNA (cfDNA)，而源自肿瘤细胞的特定部分被称为循环肿瘤 DNA (ctDNA)。 研究人员最近提出的结果与其他研究结果一致，表明术后检测到 ctDNA 的患者具有极高的后期放射学复发风险（HR = 37.66； 95% CI，4.23 至 335.49； P<0.0001)。 这种风险高于常规接受辅助治疗的 III 期结直肠癌患者。 这些发现表明，术后 ctDNA 分析有可能成为评估初次手术质量和指导辅助治疗使用的非常有价值的工具。

   与其他人一致，研究人员表明，通过纵向分析检测到的 ctDNA 变化与通过 CT 成像评估的肿瘤体积变化密切相关。 因此，ctDNA 分析具有作为评估干预影响的工具的潜力（例如 化疗、手术、射频消融术 (RFA) 和立体定向身体疗法 (SRBT)）。 研究人员表明，连续 ctDNA 分析能够通过常规方式（主要是 CT 扫描）平均提前 10 个月检测早期临床疾病复发。 因此，ctDNA 分析有可能在早期时间点提供关键的机会窗口进行干预，此时治疗方式仍然是一种选择。

2. 研究计划 2.1 总体研究设计 改进 - 观察性研究基于在 CRC 患者手术前后、辅助化疗期间和之后以及监测期间进行的一系列全面的血液采样和 ctDNA 分析。 患者从手术之日起随访 5 年。

改进观察研究在逻辑上由两部分组成：

改进观察研究第 I 部分 - 手术 这部分包括术前和手术后（手术后第 14 天）的血液采样和 ctDNA 分析，以及从切除标本中取样的组织。

改进观察性研究 第 II 部分 - 监测 这部分包括 5 年监测期内的纵向血液采样。

改善干预研究 - 改善 IT 改善第 I 部分 - 手术中包含的一部分患者是纳入改善干预研究 - 改善 IT 的候选人。 IMPROVE IT 研究在单独的方案中有详细描述。

2.2 样本量 我们将包括至少 1800 名接受治疗的 I-III 期疾病患者。 我们最近报道了一项研究，表明在 57% 的复发 II 期和 III 期患者和 0% 的非复发患者的血浆（手术后不久抽取）中可检测到 ctDNA。 在本研究中，我们预计会有更高的灵敏度，因为我们将分析比以前大 8 倍的血容量。 我们预计以下阶段分布：第一阶段，28%；第二阶段，37%；第三阶段，35%9；并估计有 223 起复发事件（预期复发率：I 期，7%；II 期，12%；III 期，17%）。 当将我们之前的结果与建议队列的规模以及预期分布和复发事件相结合时，这转化为 >99.9% 的功效，精度水平为 1%（双尾），用于确认 ctDNA 在研究结束。

2.3 生物样本（血液和组织）的采集 2.3.1 样本采集的时间点 - 改进第 I 部分 - 手术 对于第 I 部分（手术）中包含的所有患者，将在手术前后抽取血样。 只要有可能，将从手术切除的标本中收集新鲜肿瘤和邻近的正常粘膜活检组织，否则将从档案中获得福尔马林固定的石蜡包埋组织。

2.3.2 样本采集的时间点 - 改进第 II 部分 - 监测 对于第 II 部分（监测）中包含的所有患者，将在术后随访期间纵向抽取血样：第 1 年 3 次，第 2 年 3 次，第 2 年 2 次第 3 年，第 4 年和第 5 年每年一次。

2.3.3 识别 IMPROVE IT 候选人的时间点。 候选人是患有 I 期或 II 期疾病且没有符合辅助化疗条件的危险因素的患者，并且第 14 天的血液样本为 ctDNA 阳性。 接触并邀请同意接受第 14 天血样结果的患者参与 IMPROVE-IT。 在纳入之前，为患者提供 PET-CT 扫描，以确保没有遗漏任何转移。

如果第 14 天的样本为 ctDNA 阴性，则患者会被告知他们的复发风险很低，并且他们将根据 DCCG 指南接受监测。

有辅助化疗适应症的患者被告知，他们将不会收到有关其第 14 天血样分析结果的信息，因为这不会改变他们计划的治疗过程。 要求患者同意纵向采血和 ctDNA 分析（包括在改进第 II 部分 - 监测中），无论他们是否接受辅助化疗。

2.4 分子分析 2.4.1 循环肿瘤 DNA 的检测和定量 ctDNA 的检测和定量将使用我们最近开发的超灵敏靶向双链测序方法进行。 使用这种方法，我们将从每个血浆样本中对超过 5,000 个独特的 DNA 分子进行测序。 因此，可以检测等位基因频率低至 ~0.1% 的体细胞突变。 此外，我们改进的方法包括多个旨在降低错误率的步骤，包括使用独特的链特异性分子条形码 (UMI) 和每个 cfDNA 片段的冗余测序。 因此，我们可以区分聚合酶诱导的错误和真正的突变。

测序方法的目标是人类基因组中 30 亿个碱基中的 <100.000 个。 该面板包含 IntOGEN 和 TCGA 数据库中确定的最常见和最重要的 CRC 驱动突变。 多个冗余捕获探针用于每个基因以提高覆盖率并提供更高的特异性。 针对这些区域足以确保在每个 CRC 病例中至少识别出一个体细胞突变，因此应该能够评估所有纳入患者的 ctDNA 水平。 面板中包含的基因区域是：TP53 外显子 5-8（1792 个碱基），KRAS 密码子 12、13、61、117 和 146（738 个碱基），SMAD2 选择的频繁突变区域（463 个碱基），SMAD4 选择的频繁突变区域区域（513 个碱基），FAM123B 选择频繁突变区域（669 个碱基），SOX9 选择频繁突变区域（693 个碱基），APC 选择频繁突变区域（5477 个碱基），TCF7L2 选择频繁突变区域（920 个碱基），NRAS 密码子 12， 13 和 61（405 个碱基），BRAF 密码子 600 和附近的其他密码子（200 个碱基），FBXW7 选择频繁突变区域（868 个碱基），PIK3CA 8 个热点突变（905 个碱基）。

2.5 收集临床信息 该项目的核心部分涉及将 ctDNA 评估（从血液样本中收集）与治疗和结果的临床信息进行比较和关联。 关于治疗和治疗结果的临床信息将从医院记录和健康登记处收集。

2.6 预测变量、协变量和终点的定义 2.6.1 主要终点

• 3 年无病生存率 (3y-DFS) 2.6.2 次要终点
• 局部和/或远处复发（病理、放射或临床）
• 复发时间 (TTR)
• 1 年无病生存率 (1y-DFS))
• 第 5 年的总体生存率 (5y-OS)
• 分子残留病
• 分子复发时间 (TTMR) 2.6.3 安全端点
• 与每个协议抽血相关的不良事件 (AE) 的频率和严重程度。

2.6.4 端点的定义

• DFS 定义为从手术到首次出现以下任何事件的时间；局部区域复发、远处转移或任何原因导致的死亡。
• 复发时间是从手术日期到局部区域复发或远处转移，或结直肠癌死亡计算的。
• 总生存期定义为从手术到因任何原因死亡的时间。
• 分子残留疾病定义为在治疗性治疗结束后不久（术后第 1 天至第 30 天，或辅助治疗结束后第 1 天至第 30 天）抽取的血液样本中检测到循环肿瘤 DNA (ctDNA)治疗）。
• 分子复发的时间是从第一次检测不到 ctDNA 到检测到 ctDNA 计算的。

2.7 统计分析 2.7.1 DFS、OS、TTR 的分析 Kaplan-Meier 估计将用于估计复发（临床和分子）、疾病或死亡的中位时间及其置信区间，根据 UICC 阶段和/或分层术后 ctDNA 状态。 终点将使用对数秩检验或 Cox 回归模型进行评估，事件发生时间（临床或分子复发或死亡）作为反应变量，ctDNA 术后或辅助治疗作为因素。